СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕГУЛИРУЮЩИХ МЕХАНИЗМОВ АНТИТЕЛОГЕНЕЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/559 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии.

Количественные методы определения субпопуляций лимфоцитов, основанные на выявлении того или иного поверхностного маркера, не позволяют достоверно судить об их функциональной активности. Основными причинами этого являются, во-первых, морфологическая неоднородность лимфоцитарных субпопуляций (Velardi A., 1988), то есть наличие в одной и той же субпопуляции лимфоцитов клетки с различным функциональным предназначением. В частности, CD4⁺-лимфоциты содержат собственно хелперы и индукторы супрессии (Dohlesten M. , 1988). Во-вторых, показано, что в онтогенезе существуют периоды, когда на фоне количественного преобладания хелперов наблюдается высокая функциональная активность супрессоров (Вельтищев Ю.Е., 1989; Bradley L.M., 1989). В-третьих, период новорожденности сопровождается циркуляцией в крови значительного количества клеток с "двойной маркировкой" - "хелперов-супрессоров" (Вельтищев Ю.Е., 1989).

В основу большинства используемых в лабораторной практике способов оценки функционального состояния иммуноцитов человека положены различные модификации реакции бласттрансформации, основанные на использовании культур мононуклеарных клеток обследуемого индивидуума in vitro, вследствие чего для их реализации необходимо значительное количество материала (10 - 20 мл периферической крови) и немедленное проведение исследования. Это является основной причиной того, что эти методы не получили широкого распространения в педиатрии.

Известен способ определения функциональной активности тимусзависимых лимфоцитов Тютрина И.И., Смольянинова Е.С., Адамяна А.Т. (А.с. СССР N 1322151, A1, 4 GO 1 N 33/48 от 26.04.85. - Бюлл. изобрет. 1987. - N 25). Поскольку объектом исследования при применении этого способа является взвесь живых мононуклеарных клеток, к основным его недостаткам следует отнести, во-первых, необходимость немедленной обработки материала, что исключает его длительное хранение; во-вторых, способ предполагает двукратный забор венозной крови (по 5 - 6 мл) за короткий промежуток времени, что в значительной степени ограничивает его использование в педиатрической практике; в-третьих, способ позволяет производить оценку функционального состояния только Т-лимфоцитов без учета всей совокупности факторов, регулирующих антителогенез.

Предлагаемый нами способ, позволяющий использовать в качестве объекта исследования не клеточную взвесь, а сыворотку крови человека как субстрат, содержащий широкий спектр факторов, влияющих на интенсивность антителогенеза, в том числе продукты синтетической активности иммунокомпонентных клеток, лишен этих недостатков, и, следовательно, представляется более перспективным для применения в педиатрии.

Целью разработки способа и изобретения является получение адекватной информации о состоянии механизмов, регулирующих антителогенез, посредством минимального количества материала, необходимого для исследования, то есть обеспечивающего щадящие условия обследования больного.

Теоретическое обоснование предлагаемого способа оценки состояния регулирующих механизмов антителогенеза, базируется на том, что этот процесс зависит от множества факторов. Так, при реализации иммунного ответа межклеточные кооперативные взаимодействия (Musiani P., Maggiano N., 1984) осуществляются, в основном, не за счет прямых (мембранных) контактов, а посредством продуктов синтеза (интерлейкинов). Существуют также данные о регуляции интенсивности процессов антителогенеза нервной и эндокринной системами, осуществляемой посредством воздействия опиоидных факторов, нефромедиаторов, гормонов и гормоноподобных веществ (Jancovic B., 1989) на функцию лимфоцитов. Гуморальные факторы, выделяемые печенью, также могут оказывать модулирующее действие на морфофункциональное состояние иммунокомпетентных клеток (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., 1989) и т.д.

Предлагаемый способ основывается на определении эффекта сывороточных факторов крови на интенсивность первичного иммунного ответа спленоцитов мыши in vitro (см. таблицу).

На первом этапе исследования нами был осуществлен подбор условий культивирования, обеспечивающих получение оптимальной культуральной модели, которыми явились:
1. Примирование животных антигеном (эритроцитами барана) за 96 часов до начала инкубации, что позволило сократить сроки культивирования спленоцитов.

2. Иммунизация животных оптимальной дозой антигена - 20•10⁶ клеток, введенных внутривенно в объеме 0,1 мл взвеси в концентрации 200•10⁶ кл/мл.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Получают гомогенат стерильно взятых спленоцитов мышей F₁(CBAxC₅₇Bl₆) и после 3-кратной отмывки переносят по 5•10⁵ клеток в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета для культивирования. Опытная культура содержит спленоциты мыши, полную среду и сыворотку обследуемого. В качестве контроля используют культуру, содержащую спленоциты и полную среду культивирования. При этом опытная культура отличается от контрольной только присутствием сыворотки обследуемого индивидуума.

2. Все описанные процессы проводят в стерильных условиях, в ламинарном боксе. Взвеси клеток инкубируют в CO₂-инкубаторе с автоматическим режимом культивирования.

3. Ежедневно в опытной и контрольной культурах подсчитывают количество антителообразующих клеток (АОК) методом бляшкообразования по Ierne N.K., Nordin A. A. (1963). Эффект сыворотки соответствует разности числа бляшкообразующих (антителопродуцирующих) клеток в опытной и контрольной взвесях спленоцитов.

4. На основании полученных данных проводят построение кривых зависимости разности количества АОК в контрольной и опытной культурах ("K") от времени инкубации.

5. Индивидуальный анализ полученной кривой проводят по следующим параметрам:
1). Значение ("K") в нулевой точке ("K₀").

2). Тангенс угла наклона кривой (tgα) через 24 часа от начала инкубации.

3). Значение ("K") в экспериментальной точке кривой во временном интервале 0 - 72 часа ("K₁").

4). Тангенс угла наклона кривой (tgβ) во временном интервале 72 - 96 часов.

5). Значение "K" через 96 часов от начала инкубации ("K₂").

Подробные сведения о параметрах кривой приведены в таблице.

Предлагаемым способом было обследовано 14 здоровых доноров. Анализ параметров первичного иммунного ответа позволил выявить три основных типа эффекта сывороточных факторов крови: I - стимулирующий; II - ингибирующий; III - равновесное состояние регулирующих механизмов в момент воздействия.

В целом характер кривой соответствует "стимулированному" типу, если во временном диапазоне 0 - 72 часов она располагается выше оси абсцисс, а "ингибированному" типу - ниже оси абцисс.

Клинические примеры
Предлагаемый способ в ряде случаев более адекватно отражает состояние регуляторных механизмов иммунной системы, чем широко распространенные количественные методы оценки регуляторных субпопуляций.

Пример 1. Больной К. Возраст 6 лет. Клинический диагноз - Бронхиальная астма.

Результаты иммунологического обследования: T-лимфоциты (CD5) - 66,5%; T-хелперы/индукторы супрессии (CD4) - 51,0%; T-супрессоры/цитотоксические клетки (CD8) - 21,0%; соотношение числа T-хелперов и T-супрессоров - 2,4; B-лимфоциты (sIg) - 6,5%; иммуноглобулины (г/л) A - 0,54; M - 0,80; G - 8,60.

Основные параметры кинетической кривой суммарного эффекта сывороточных факторов крови:
"K₀" = -314; tg α = -26; "K₁" = -319; tg β = +31; "K₂" = +433.

Количественные показатели иммунного статуса у обследуемого больного противоречивы: с одной стороны, наблюдается количественное преобладание T-хелперов, а с другой, - сниженное число B-лимфоцитов и низкие концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови. Предлагаемый нами способ свидетельствует о преобладании ингибирующего эффекта сывороточных факторов крови через 0 - 72 часа от начала исследования с выраженным ингибирующим "экспресс"-эффектом, что объективно отражает состояние механизмов, регулирующих антителогенез, в момент обследования больного.

Пример 2. Больная Р. Возраст 8 лет. Клинический диагноз - Аллергический экзогенный альвеолит.

Результаты иммунологического обследования: T-лимфоциты (CD5) - 56,5%; T-хелперы/индукторы супрессии (CD4) - 40%; T-супрессоры/цитотоксические клетки (CD8) - 33%; соотношение числа T-хелперов и T-супрессоров - 1,2; B-лимфоциты (sIg) - 33%; иммуноглобулины (г/л) A - 1,41; M - 0,76; G - 15,38.

Основные параметры кинетической кривой суммарного эффекта сывороточных факторов крови:
"K₀" = +510; tg α = +67; "K₁" = +2115; tg β = -4,8; "K₂" = +339.

Количественные иммунологические показатели, как и в примере 1, противоречивы: преобладание числа T-супрессоров сочетается с высоким уровнем B-лимфоцитов и значительными концентрациями иммуноглобулинов. Способ оценки функционального состояния регуляторных механизмов по эффекту сывороточных факторов in vitro свидетельствует о выраженном стимулирующем воздействии на процесс антителогенеза, что соответствует показателям гуморального иммунитета у больной.

Таким образом, приведенные клинические примеры свидетельствуют о том, что в ряде случаев предлагаемый способ является более адекватным для оценки механизмов, регулирующих антителогенез.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии. Способ основан на определении эффекта действия сывороточных факторов на процесс синтеза антител при индукции первичного иммунного ответа в культуре in vitro. Мышей иммунизируют внутривенно эритроцитами барана в дозе 20 • 10⁶ клеток/мышь. Через 96 ч получают гомогенат спленоцитов мыши и культивируют его с сывороткой крови обследуемого. Подсчитывают количество антителообразующих клеток в культуре ксеногенных лимфоцитов обследуемого по отношению к аналогичному показателю в контрольной пробе в 0,24, 72 и 96 ч от начала культивирования. И при величине разности между опытной и контрольной пробами больше нуля оценивают эффект сывороточных факторов крови обследуемого как стимулирующий, а при величине разности меньше нуля - как ингибирующий. Способ информативен, полученные результаты адекватно отражают состояние регуляторных механизмов антителогенеза посредством исследования минимального количества материалов. 1 табл.

Способ определения активности регулирующих факторов антителогенеза, заключающийся в том, что иммунизируют мышей эритроцитами барана внутривенно дозой 20 • 10⁶ клеток/мышь, через 96 ч получают гомогенат спленоцитов мыши и культивируют его с сывороткой крови обследуемого, подсчитывают количество антителообразующих клеток в культуре ксеногенных лимфоцитов обследуемого по отношению к аналогичному показателю в контрольной пробе в 0,24, 72 и 96 от начала культивирования, и при величине разности между опытной и контрольной пробами больше нуля оценивают эффект сывороточных факторов крови обследуемого как стимулирующий, а при величине разности меньше нуля - как ингибирующий.