ШТАММ ESCHERICHIA COLI XLI-BLUE/PINSR - ПРОДУЦЕНТ ПРЕПРОИНСУЛИНА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/21 

Изобретение относится к области микробиологической и фармацевтической промышленности и может быть использовано для создания лекарств.

Создание высокоэффективного штамма-продуцента препроинсулина - одна из важнейших биотехнологических задач, решению которой посвящены многочисленные исследования последних 10-15 лет. Существует два принципиально отличных пути: первый путь - создание систем, секретирующих препроинсулин; второй путь - интрацеллюлярное накопление конечного продукта экспрессии в тельцах включения. У каждого из этих путей есть свои преимущества и недостатки. В первом случае конечный продукт попадает во внеклеточное пространство. Это упрощает процесс выделения и очистки препроинсулина. Однако уровень экспрессии конечного продукта в таких системах невысок. В системах второго типа экспрессия намного выше, однако локализация рекомбинантного белка в тельцах включения требует больших технологических затрат для его выделения.

Другая проблема связана с выбором технологии получения инсулина. Путь решения этой проблемы во многом определяется аминокислотной последовательностью препроинсулина. Один путь - ничего не изменяя, воспользоваться естественной первичной структурой препроинсулина. Недостатком такого подхода является неизбежность использования токсичного соединения (бромциана) для отщепления лидерной последовательности. Другой путь - создание искусственного линкера между лидерной последовательностью и проинсулином, который можно легко "разрезать" трипсином. Такой подход позволяет отказаться от бромцианового гидролиза и сократить технологическую цепочку получения конечного продукта.

Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому результату к предложенному изобретению является создание и использование вышеуказанного штамма E.coli, продуцирующего инсулин (Nilsson et al., Integrated production of human insulin and its c-peptide J. Biotechnology 1996, 48, 41-50). Отличительными особенностями являются: 1. Использование штамма E.coli 017; 2. Дополнительного участка, ответственного за связывание IgG, что дало возможность авторам приведенной работы модифицировать процедуру выделения и очистки конечного продукта так, чтобы наряду с инсулином было возможным выделять пептид C, который имеет по их мнению выраженную биологическую активность.

Задачей настоящего изобретения является создание штамма, продуцирующего препроинсулин с высоким выходом и характеристиками, позволяющими получать инсулин по простой и эффективной технологии.

Сущность изобретения состоит в создании штамма E.coli XLI-Blue/pInsR - продуцента препроинсулина, характеризующегося наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pInsR.

Штамм-продуцент Escherichia coli XLI - Blue/pInsR характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. На агаре "Дифко" клетки образуют круглые гладкие колонии с ровными краями. При росте в жидкой питательной среде образуют интенсивную ровную муть.

Физико-химические признаки. Клетки растут в температурном диапазоне от 8^oC до 40^oC, оптимум pH от 6,8 до 7,0. В качестве источников азота, углерода и других необходимых компонентов используются минеральные соли, казеин, пептон, дрожжевой автолизат и т.д.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к тетрациклину и ампициллину.

Штамм-продуцент E.coli XLI-Blue/pInsR отличается от штамма-реципиента E. coli XLI-Blue наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pInsR, которая придает дополнительную устойчивость к ампициллину.

Клетки E. coli XLI-Blue/pInsR являются продуцентом препроинсулина. При индукции изопропил-бета-D-тиогалактозидом происходит интенсивный синтез данного белка, который накапливается в виде телец включения. Выход препроинсулина составляет более 30% от суммарного белка клеток.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Для получения штамма-продуцента проводят трансформацию штамма E.coli XLI-Blue, используя плазмиду pInsR (приведена в конце описания) (заявка на изобретение N 97114220/13 от 28.08.97). Отобранные клетки, несущие плазмиду InsR, являются продуцентом препроинсулина.

На следующем этапе проводят выращивание биомассы в необходимом количестве. Для контроля за динамикой роста культуры пробы периодически отбирают и контролируют. За несколько часов (в зависимости от объема ферментера) до окончания процесса наработки культуры вносят индуктор.

После завершения процесса ферментации суспензию клеток центрифугируют. Отобранные клетки разрушают.

Далее рекомбинантный белок подвергается реакции сульфитолиза с образованием рекомбинантного белка - S-сульфоната. Данный тип позволяет стабилизировать белок и эффективно проводить его выделение и очистку с помощью анионообменной хроматографии за счет появления 6 отрицательно заряженных групп S-SO₃.

Затем рекомбинантный белок-S-сульфонат подвергают обессоливанию на колонке с Сефадексом G-25 и ренатурации в разбавленном растворе с помощью 2-меркаптоэтанола.

Очищенный ренатурированный рекомбинантный белок подвергают трипсинолизу. Поскольку основными продуктами трипсинолиза являются ди-Arg-инсулин и Arg-инсулин, дальнейшее превращение их в инсулин проводят с использованием карбоксипептидазы B. Таким образом ренатурированный рекомбинантный белок может непосредственно превращаться в инсулин, минуя стадию получения проинсулина. Именно это позволяет исключить в технологической схеме стадию расщепления рекомбинантного белка бромцианом, которая необходима для получения проинсулина из нативного препроинсулина. Исключение из технологической схемы стадии, связанной с бромцианом, не только уменьшает себестоимость конечного продукта за счет непосредственного сокращения числа стадий, но и значительно снижает вредность данного производства. Кроме того замена химического расщепления рекомбинантного белка на ферментативное является очень выгодной, так как обеспечивает более высокие выход и качество конечного продукта.

После ферментативной обработки ренатурированного рекомбинантного белка трипсином и карбоксипептидазой B выделение и очистку инсулина проводят с использованием катионообменной хроматографии.

Фракции с высоким содержанием инсулина объединяют и концентрируют на ультрафильтрационной установке.

Заключительную очистку инсулина проводили с помощью гель-фильтрации. Фракции с инсулином лиофилизировали.

Биологическая активность полученного инсулина составила 29 Ед/мг. Молекулярную массу полученного инсулина определяют с помощью масс-спектрометрии. N-концевую последовательность (9 шагов) полученной субстанции определяли с помощью метода Сэнгера. Анализ аминокислотных последовательностей показал наличие только двух полипептидных цепей, принадлежащих инсулину.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения инсулина. Штамм-продуцент препроинсулина получают путем трансформации штамма E. coli XLI - Blue с использованием плазмиды pInsR и отбирают клетки, несущие указанную плазмиду. Штамм продуцирует препроинсулин с высоким выходом и характеристикой, позволяющей получать инсулин путем ферментативного расщепления.

Штамм Escherichia coli XLI - Blue / pInsR - продуцент препроинсулина.