СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНЫХ К ГЕМОКОНТАКТНЫМ ПРЕПАРАТАМ ДЛЯ ГЕМОСОРБЦИОННЫХ ПРОЦЕДУР Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для предварительной оценки индивидуальной чувствительности больных к гемосорбционным препаратам, которые планируется применять в ходе эфферентной терапии.

В ряде случаев перед введением лекарственного средства в организм пациента проводят оценку его индивидуальной чувствительности к назначенному препарату, например дифтерийной сыворотке (см. Инструкцию по применению сыворотки противодифтерийной концентрированной жидкой. Утв.зам.нач.главного управления карантинных инфекций М.П.Наркевич, 13.09.87). Оценка индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам для гемосорбционных процедур до настоящего времени не осуществляется. Гемосорбция проводится по медицинским показателям при определенных состояниях с учетом сорбционных характеристик гемоконтактных препаратов.

Гемосорбционная терапия может сопровождаться развитием характерных осложнений, среди которых наиболее часто встречаются: коллаптоидные реакции, озноб, нарушение свертывающей системы крови, рекоматозное состояние. По данным Ю.М.Лопухина, озноб различной интенсивности отмечался у 20% пациентов, подвергнутых гемосорбционой терапии [1] . Озноб является внешним проявлением процесса генерализованного воспаления (Whole body inflammation [2]), которое развивается в ответ на взаимодействие клеточных и гуморальных систем крови с сорбентами. Доминирующая роль в запуске процессов, связанных с признаками генерализованного воспаления, принадлежит системе контактной активации, которая как непосредственно через свои компоненты, так и через инициацию ею других гуморальных систем может стимулировать лейкоциты и эндотелиальные клетки [3]. Поскольку процесс активации лейкоцитов при гемосорбции занимает центральное место, интегрируя другие ключевые события в перфузируемой крови, наиболее ранние показатели активации этих клеток могут служить критерием оценки индивидуальной чувствительности пациентов к контакту его крови с сорбционными препаратами.

Изобретение позволяет предварительно оценивать изменения реактивности лейкоцитов крови больного in vitro при контакте клеток в процессе гемоперфузии через конкретный сорбционный препарат перед проведением лечебной процедуры гемосорбции. Причем предложенный метод является универсальным и позволяет определять чувствительность лейкоцитов крови к гемоконтактным препаратам различной природы, что снизит количество осложнений, связанных с процедурой гемосорбции.

Стереотипной реакцией лейкоцитов на активирующее воздействие различной природы является индукция генерации этими клетками активных форм кислорода (АФК). Эта реакция развивается в течение нескольких секунд и длится десятки минут [4].

Сущность изобретения сводится к следующему. Перед гемосорбционной процедурой оценивают in vitro изменение реактивности лейкоцитов крови методом хемилюминесценции (ХЛ) путем определения индекса ХЛ в чистой пробе крови и в пробе крови с сорбентом и по результатам сравнения значений индекса ХЛ в названных пробах судят об индивидуальной чувствительности.

Авторами исследовалась индивидуальная чувствительность полиморфоядерных лейкоцитов (ПЯЛ) крови доноров к контакту с различными сорбентами (фиг. 1), при этом использовалась гепаринизированная кровь семи доноров. В качестве гемоконтактных препаратов апробированы:
СКН-2К - угольный гемосорбент;
ГПА - гранулированный поперечносшитый аубазидан;
Агароза 4Б - гранулированная крупнозернистая агароза 4Б (D - 0,4-1,0 мм);
Имасорб A-710 - белок A Staphylococcus aureus, иммобилизованный на крупнозернистой агарозе 4Б.

Установлено, что активация лейкоцитов крови каждого донора, оцениваемая методом ХЛ, зависит как от химической структуры гемоконтактного препарата, так и от индивидуальной реактивности донора. Кроме того, исследовалась чувствительность ПЯЛ доноров к сорбентам различной природы (фиг. 2).

Сравнивали чувствительность лейкоцитов крови доноров к гемоконтактным препаратам различной природы. Авторами проанализирована реакция клеточных элементов крови на следующие сорбенты:
СКН-2К - угольный сорбент;
ГПА - гранулированный поперечносшитый аубазидан;
Аг.к.з. - гранулированная крупнозернистая агароза 4Б;
Имасорб A-700 - белок A Staphylococcus aureus, иммобилизованный на агарозе 4Б;
Имасорб G-700 - рекомбинантный белок G Streptococcus, ковалентно связанный с агарозной матрицей;
Инсулин, иммобилизованный на агарозе;
Бычий сывороточный альбумин (БСА), иммобилизованный на агарозе 4Б;
Полимиксин B, иммобилизованный на агарозе 4Б;
Кроличьи антитела против белков лошадиной сыворотки, иммобилизованные на агарозе 4Б;
ДАТс - кроличьи аффинноочищенные антитела против дифтерийного анатоксина, иммобилизованные на крупнозернистой агарозе 4Б;
K -контрольная проба. Спонтанная ХЛ лейкоцитов крови доноров без контакта с сорбентами.

Установлено, что гемоконтактные препараты разной химической структуры обладают способностью в различной степени активности лейкоцитов крови, понижая либо повышая продукцию клетками АФК. Хемилюминесцентная активность зависит как от природы самого носителя, так и от структуры активного лиганда, иммобилизованного на этом носителе и придающего селективные свойства гемосорбенту.

Повышение индексом ХЛ его спонтанных значений дает основание предполагать возможность развития осложнений на процедуру гемоперфузии, связанных с запуском и поддержанием процесса генерализованного воспаления. При наличии соответствующей аппаратуры (люминометр любого типа) предварительная оценка индивидуальной биосовместимости больного с конкретным гемосорбентом, планируемым для проведения лечебных мероприятий, может быть с успехом применена в любых центрах эфферентной терапии, что снизит количество осложнений, связанных с процедурой гемосорбции. Проведение пробы не требует большого объема крови и занимает малый промежуток времени.

Изобретение реализуется следующим образом. Проба на индивидуальную чувствительность больного к сорбенту должна проводиться перед выполнением лечебного мероприятия.

Схема постановки пробы.

1. У больного берут венозную кровь в пробирку с гепарином в объеме 0,5 мл.

2. Подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мм³ (по возможности подсчитать количество гранулоцитов и мононуклеаров). В наших примерах расчет индекса активации производили, учитывая количество полиморфноядерных лейкоцитов, так как эти клетки вносят основной вклад в генерацию АФК.

3. В кювету люминометра вносят:
- 100 мкл сорбента;
- 100 мкл гепаринизированной крови больного;
- 100 мкл раствора люминола;
- 700 мкл раствора Хэнкса без фенолового красного.

4. Параллельно ставя контрольную пробу без сорбента для оценки спонтанной хемилюминесценции лейкоцитов.

5. Регенерацию АФК можно проводить на любом люминометре. Мы оценивали состояние хемилюминесценции на люминометре LKB-Wallac 1251 (Швеция) в термостатируемом режиме (t = 37,0^oC) при постоянном перемешивании содержимого кювет с автоматическим учетом результатов на компьютере, который управлял работой люминометра. Показатели ХЛ в каждой кювете регистрировали каждые 40 секунд. Общее время подсчета пробы - 60 мин.

6. В пробах регистрировали максимальный уровень ХЛ (Max(vV), время развития максимальной реакции (t(min) и интегральный показатель активации клеток - светосумму (LS)(Уровень активации клеток в ответ на их контакт с сорбентами оценивали индексом ХЛ, который представляет собой отношение светосуммы ХЛ к количеству нейтрофилов в пробе, умноженное на 1000 (LS/ПЯЛ•1000).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет предварительно оценить индивидуальную чувствительность лейкоцитов больного к гемоконтактному препарату, который предлагается использовать для лечебных целей.

Источники информации:
1. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н. Гемосорбция. -М.: Медицина, 1985, 287 с.

2. Wachtfogel Y. T. , Dela Cadena R.A., Colman R.W.Structural biology, cellular interactions and pathophysiology of the contact system//Thromb. Rec. 1993.-v.72.-p.

3. Colman R. W. Surface mediated defence reactions: the plasma contact activation system// J. Clin. Invest. 1984.-v.-73.-p.1249-1253.

4. Sclar L.A., Jesaitis A.J., Painter R.G., Cochzane C.G. The kinetics of neutrophil activation // J.Biol.Chem.-1981.-v. 256.-N19.-p.9909-9914.

5. Инструкция по применению сыворотки противодифтерийной концентрированной жидкой. Утв.зам.начальника Главного управления карантинных инфекций М.П.Наркевич 13.09.87 г.

Способ может быть использован для предварительной оценки индивидуальной чувствительности больных к гемосорбционным препаратам. Перед гемосорбционной процедурой оценивают in vitro изменение реактивности лейкоцитов крови методом хемилюминесценции (ХЛ) путем определения индекса ХЛ в чистой пробе крови и в пробе крови с сорбентом. Превышение индексом ХЛ его спонтанных значений дает основание предполагать возможность развития осложнений на процедуру гемоперфузии. Способ позволяет определять чувствительность лейкоцитов крови к гемоконтактным препаратам различной природы, что снижает количество осложнений, связанных с процедурой гемосорбции. 2 ил.

Способ оценки индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам для гемосорбционных процедур, отличающийся тем, что перед гемосорбционной процедурой оценивают in vitro изменение реактивности лейкоцитов крови методом хемилюминесценции (ХЛ) путем определения индекса ХЛ в чистой пробе крови и в пробе крови с сорбентом и по результатам сравнения значений индекса ХЛ в названных пробах судят об индивидуальной чувствительности.