ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ, ОБРАЗОВАННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ ЛОШАДИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНОЙ СЫВОРОТКИ, И СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕМОСОРБЦИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ДИФТЕРИИ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/395 A61M1/38 

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к экстракорпоральным методами воздействия на организм, и может быть использовано при лечении патологических состояний, требующих удаления аутоформирующихся или искусственно наведенных путем инъекций серотерапевтических препаратов иммунных комплексов.

Усиленное иммунокомплексообразование является обязательным компонентом многих заболеваний, что нередко ведет к утяжелению патологического процесса. С другой стороны, при патологии инфекционного генеза общепризнанным и широкораспространенным методом лечебного воздействия на процесс остается применение специфических иммунных сывороток или иммуноглобулиновых антительных препаратов, которые заведомо направлены на формирование в организме специфических иммунных комплексов с целью облегчения элиминации из организма инфекционных агентов или их токсинов. Так, например, при дифтерийной инфекции больному неоднократно вводят парентерально значительные количества (до 1000000 МЕ) противодифтерийной сыворотки (ПДС), что нередко приводит к развитию осложнений в виде сывороточной болезни (1).

Эффективные методы терапии, среди которых все большее распространение находит специфическая или селективная плазмо- и гемосорбция, довольно широко используются в клинике для коррекции интоксикационных состояний. Обычно применяемые для этих целей угольные сорбенты малоэффективны, так как не способны по своим характеристикам элиминировать из циркуляции высокомолекулярные макроагрегаты, которыми являются реальные циркулирующие иммунные комплексы.

Наиболее близким по сущности к заявляемому иммуносорбенту является препарат Имасорб А-700 (2), который может быть выбран в качестве прототипа. Это твердофазный белок A Staphylococcus aureus, который прочно и обратимо связывает иммуноглобулины человека и разных видов млекопитающих в области Fc-фрагмента молекулы. Причем комплексированный иммуноглобулин имеет больший аффинитет к белку A, чем нативная молекула (3), что будет определять приоритет элиминации токсинов в составе иммунного комплекса (ИК) по сравнению с нативным иммуноглобулином (I). Однако Ig не всех видов млекопитающих обладают одинаковым аффинитетом к белку A St.aureus. Исходя из данных литературы сродство Fc-фрагментов Ig к белку A существенно у млекопитающих: человек, мышь, бык, кролик, морская свинка, собака, свинья (++); и незначительно либо отсутствует: крыса, коза, овца, лошадь, корова, цыпленок (+ или -) (4).

Для практического применения крайне важна наибольшая емкость селективных сорбентов к IgG - лошади, человека, козы, мыши, так как иммунные сыворотки и очищенные иммуноглобулины (а также мышиные моноклональные антитела) именно этих видов животных и человека используются для лечения ряда заболеваний методом серотерапии (лошадиные антисыворотки - противодифтерийная, противобутулическая; козий противостафилококковый глобулин и т.д.). наиболее часто используемые в клинической практике антисыворотки (лошадиная, козья) слабо взаимодействуют с белком A St.aureus.

Учитывая это обстоятельство, нами был сконструирован гемосорбент на основе крупнозернистой агарозной матрицы и рекомбинантного Ig-связывающего белка G Streptococcus группы G (Имасорб G-700). Согласно существующим данным белок G Streptococcus наиболее интенсивно взаимодействует с Ig человека, мыши, лошади, козы, овцы, быка, кролика, свиньи (++); менее слабое связывание осуществляется с Ig крысы, морской свинки, собаки (+) и не взаимодействует с Ig цыпленка (-) (4).

Нами была проведена сравнительная характеристика сорбционных свойств препаратов Имасорб A-700 и Имасорб G-700. Проведенные эксперименты выявили следующую зависимость сродства Ig животных к иммобилизованным белкам A и G. Имасорб A-700: кошка > кролик > человек > коза > бык > лошадь. Имасорб G-700: лошадь > кролик > коза > бык > человек > кошка.

Таким образом, с точки зрения наиболее эффективной элиминации ЦИК, образованных иммуноглобулинами лошади (в частности при применении ПДС) целесообразно использовать иммобилизованный белок G Streptococcus. В экспериментах на морских свинках с использованием модели дифтерийной токсемии (в/в введение дифтерийного токсина или анатоксина) были апробированы сорбенты Имасорб A-700 и Имасорб G-700. В контрольных экспериментах гемоконтактным препаратом служила чистая агарозная матрица, которая является носителем активных лигандов селективных сорбентов.

В настоящее время эффективные методы (плазмаферез, гемосорбция) достаточно редко применяются в тактике лечения дифтерии, в основном при крайне тяжелых состояниях. С другой стороны, применение ПДС и противодифтерийного γ -глобулина регламентировано руководящими документами и используется повсеместно. Существует также лечебная тактика, когда гемосорбцию осуществляют после введения ПДС (5). Данная процедура может быть выбрана в качестве прототипа заявленного способа. Существенным недостатком при ее выполнении является использование неселективных угольных сорбентов, которые по своим физико-химическим характеристикам не способны удалять из циркуляции высокомолекулярные соединения в виде иммунных комплексов.

В предлагаемом нами способе проведения лечебной гемосорбции с использованием селективных препаратов предполагается первоначальное создание транзиторного комплексоформирующего состояния с последующим удалением образовавшихся макроагрегатов на сорбентах. Сочетание данных процедур (гемосорбция и серотерапия) предлагается обозначить как серосорбцию. Серосорбция может быть использована в 3-х вариантах.

1. Наведение транзиторного комплексоформирующего состояния (на примере иммунокомплексного) возможно in vivo, т.е. при инъекции адекватных доз лечебных иммунных сывороток или чистых специфических антител непосредственно в кровоток при дальнейшем подключении к системе циркуляции селективных для образовавшихся комплексов гемосорбентов. Данная тактика использована в прототипе, но были задействованы угольные гемосорбенты.

2. Процедура серосорбции может быть полностью вынесена in vitro, например, при ее сочетании с плазмаферезом. К сепарированной плазме необходимо добавить эквивалентное удаляемому антигену количество специфических антител, пропустить плазму через аффинный сорбент и перфузировать ее обратно больному.

3. В случае склонности индивидуума (или вида животных при экспериментальных исследованиях) к развитию анафилактической реакции, которая может запускаться образованием комплекса антиген-антитело, введение специфических антител или иммунных сывороток необходимо вынести за пределы организма. В данной ситуации подача лечебных препаратов может производиться в экстракорпоральный контур непосредственно в смеситель перед колонкой с селективным сорбентом.

Нами экспериментально на морских свинках с использованием модели дифтерийной интоксикации апробирован вариант серосорбции 3, в котором применялись разные селективные сорбенты и иммунные сыворотки, что иллюстрируется соответствующими примерами.

Пример 1. Серосорбция на препарате Имасорб A-700 с использованием кроличьих аффинноочищенных антитоксических противодифтерийных антител.

Известно, что морские свинки склонны к развитию анафилаксии. Наши предыдущие эксперименты с использованием иммуносорбента ДАТс в модели дифтерийной токсемии показали характерную выраженную анафилактическую реакцию как у морских свинок, так и у мышей. Поэтому опыты с использованием препарата Имасорб A-700 проводили по следующей схеме. Были использованы морские свинки обоего пола весом 250-350 г. Под нембуталовым наркозом им проводили катеризацию общей сонной и наружной яремной вены для подключения экстракорпорального контура. Перед процедурой гемосорбции свертывающую систему крови блокировали гепарином. Имасорб A-700 помещали в колонку объемом 0,5 мл и подключали к системе кровообращения по схеме артерия ---> вена. Кровь на колонку подавали перистальтическим насосом со скоростью 15-20 мл/час, время гемоперфузии составляло 60-90 минут. Дифтерийный токсин в дозе 2 DLM на 250 г массы тела животного вводили внутриартериально. Пробу крови для исходной регистрации токсина в кровотоке брали через 3 мин после его введения. Кроличьи аффиноочищенные антитоксические противодифтерийные антитела в объеме 2 мл подавали перистальтическим насосом в течение всей процедуры гемоперфузии. Антитела вводили в смеситель, расположенный непосредственно перед колонкой с сорбентом. Скорость подачи раствора антител 1-2 мл/час. Забор крови для исследования осуществляли из трех точек: из артериального катетера (отражает наличие токсина и других показателей в системном кровотоке) (30/1, 60/1, 90/1), после смесителя (30/2, 60/2, 90/2) и после сорбционной колонки (30/3, 60/3, 90/3). Кровь забирали каждые 30 мин в течение всей гемоперфузии и через 30 минут после окончания процедуры.

Динамика изменения количества дифтерийного токсина (Аг), антитоксических антител (Ат) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в кровотоке экспериментальных животных представлена в таблице 1.

Отмечается достоверное снижение титра Аг как в контрольной группе животных, так и у животных, подключенных к Имасорбу A-700. В опытной группе падение титра Аг на протяжении гемоперфузии более выражено, особенно в пробах после колонки, где токсин не определялся через 30 и 60 мин гемосорбции. Уровни антитоксических Ат достоверно не изменялись за время гемоперфузии и через 30 мин после ее окончания. ЦИК в контрольной группе животных определялись в повышенных количествах практически во всех пробах. В опытной группе повышенное количество ЦИК регистрировалось в пробах крови после смесителя и значительно меньше их оставалось в пробах после сорбента, так как основная часть иммунных комплексов фиксировалась на иммобилизованном белке A. Правомерность данного утверждения подтверждает пример 2.

Пример 2. Регистрация макромолекул, фиксированных на гранулах сорбентов.

После окончания процедуры гемосорбции промывали многократным объемом забуферного физиологического раствора pH 7,2-7,4, переносили из колонок в пластиковые пробирки и консервировали мертиолятом в конечной концентрации 1: 10000. В дальнейшем гранулы сорбента исследовали иммуногистохимически, что позволило идентифицировать молекулы белков, фиксированные на сорбенте. На гранулах регистрировали дифтерийный токсин, IgG морской свинки и IgG кролика, который представлен специфическими антитоксическими антителами. Результаты исследования иллюстрирует таблица 2.

Как видно из таблицы, чистая агарозная матрица слабо фиксирует белковые молекулы (от 0 до 3% окрашенных гранул). В то же время Имасорб A-700 сорбирует как IgG морской свинки, так и IgG кролика. Кроличьи антитела фиксированы на сорбенте в основном в комплексированном состоянии, так как в подавляющем проценте случаев на этих же гранулах регистрируются и молекулы дифтерийного токсина.

Таким образом, результаты анализа гранул сорбентов подтверждают данные по динамике токсина, антитоксина и ЦИК, полученные при исследовании плазмы крови животных.

Учитывая то обстоятельство, что лечебные противодифтерийные сыворотки получают путем иммунизации лошадей и что иммобилизованный белок G стрептококка, апробированный в предварительных экспериментах, более интенсивно фиксирует IgG именно этого вида животных, нами проведена серосорбция (вариант 3) с использованием препарата Имасорб G-700 и стандартной противодифтерийной лошадиной сыворотки (ПДС).

Пример 3. Сорбция с использованием препарата Имасорб G-700 и ПДС.

Схема проведения эксперимента аналогична схеме, описанной в примере 1. Отличия заключаются в следующем:
1) Использовали препарата Имасорб G-700 в объеме 0,5 мл,
2) Вместо кроличьих антител в смеситель на протяжении всей процедуры гемоперфузии подавали ПДС в суммарной дозе 50 МЕ,
3) Вместо дифтерийного токсина использовали анатоксин в дозе 20 Lf.

Результаты исследования представлены в таблице 3.

Динамика изменения Аг, Ат и ЦИК в кровотоке напоминает результаты, полученные с использованием препарата Имасорб A-700. Чистая агароза слабо фиксирует ЦИК, в то время как иммобилизованный белок G стрептококка интенсивно выводит из циркуляции специфический IgG лошади в комплексе с анатоксином.

Таким образом, предложенная процедура серосорбции и иммуносорбент для ее проведения после соответствующих испытаний могут быть успешно внедрены в клиническую практику, в частности, при лечении дифтерии.

Список использованных источников информации
1. Иванов Ф. К. Сывороточная болезнь и побочные осложнения при лечении антибиотиками. - М.: Медицина, 1967. - 180 с.

2. Патент РФ N 2052998, A 61 M 1/36. Способ лечения иммунокомплексных состояний. - Опубл. Б.И. N 3, 1996.

3. Тарханова И.А. и др. Сравнительный анализ взаимодействия белка A St. aureus с нативным, восстановленным и агрегированным IgG. - ЖМЭИ. - 1979. - N 6. - С. 27-31.

4. Current Protocols in Immunology, 1988.

5. Фаворова Л. А., Астафьева В.Н., Корженкова М.П. Дифтерия. - М.: Медицина, 1988. - 208 с.

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к экстракорпоральным методам воздействия на организм. Предложен гемосорбент на основе крупнозернистой агарозной матрицы и рекомбинантного белка G Streptococcus группы G. Предложен способ проведения лечебной гемосорбции, согласно которому кровь пациента с введенными лечебными сыворотками пропускают через сорбент - рекомбинантный IgG-связывающий белок G Streptococcu группы G, иммобилизованный на агарозной матрице, лечебные сыворотки вводят в экстракорпоральный контур непосредственно перед колонкой на протяжении всей процедуры. Технический результат: обеспечено удаление из циркуляции высокомолекулярных соединений в виде иммунных комплексов. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Иммуносорбент для удаления иммунокомплексов, образованных иммуноглобулинами лошади после введения противодифтерийной сыворотки, включающий агарозную матрицу с иммобилизованным активным лигандом, отличающийся тем, что в качестве активного лиганда содержит рекомбинантный JgG-связывающий белок G Streptococcus группы G. 2. Способ проведения гемосорбции при лечении дифтерии, предусматривающий введение в кровоток пациента лечебных иммунных сывороток или чистых специфических антител с последующим пропусканием крови через сорбент, отличающийся тем, что кровь пропускают через иммуносорбент - рекомбинантный JgG-связывающий белок G Streptococcus группы G, иммобилизованный на агарозной матрице, а лечебные сыворотки вводят в экстракорпоральный контур непосредственно перед колонкой на протяжении всей процедуры.