СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к области медицины в частности к иммунологии и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии бактериальных и вирусных заболеваний.

Современные коммерческие препараты гаммаглобулина содержат в основном IgG-иммуноглобулины (85-93%) и лишь 1-3% иммуноглобулинов других классов.

В настоящее время в ряде стран выпускаются и успешно применяются в клинике препараты, обогащенные IgM и IgA как для внутримышечного, так и для внутривенного введения. Фирма "Behring-werke" ФРГ производит гамма-М и гамма-А-концентраты (по 80% и по 20% IgM и IgA). Во Франции выпускается препарат Ig GAM (40% IgG, 20% IgA и 25% IgM). Аналогичные препараты выпускаются в Италии, Венгрии и других странах.

К настоящему времени наклонены убедительные данные об эффективности введения препаратов иммуноглобулинов энтеральным путем для профилактики и лечения кишечных заболеваний у детей.

В Японии, Швейцарии, США, Англии разработаны иммуноглобулиновые препараты для перорального введения. В США в терапевтической практике применяют перорально для профилактики и лечения кишечных инфекций препарат, содержащий до 70% IgG и 20% углеводов-наполнителей. Во Франции, Англии, Швейцарии, США разработаны препараты для орального применения, содержащие комплекс иммуноглобулинов молозива и сывороточных иммуноглобулинов. По данным Losonsky (1978) ротавирусная инфекция излечивается после орального применения иммуноглобулина, причем в фекалиях обнаруживаются иммунные комплексы ротавирус+иммуноглобулин, составляющий до 50% вводимого препарата.

Фирма "Immuno" (Австрия) выпускает IgAbulin для орального применения для профилактики и лечения некротизирующих энтероколитов.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) из осадка Б (III фракции Кона), являющегося балластной фракцией при спиртовом фракционировании сыворотки (Экспериментально-производственный регламент N 338-91 Иммуноглобулин человека, сухой, для энтерального применения Утвержден шестого сентября 1991 года). В КИП отмечаются повышенные титры антител против ряда энтеробактерий (шигелл, эшерихий, сальмонелл), а также псевдомонад, менингококков по сравнению с коммерческими препаратами гаммаглобулина. Если нормальный иммуноглобулин содержит IgM и IgA в количествах, не превышающих 4 то в комплексном препарате их содержание увеличено до 15-25%
Способ получения КИП предусматривает обработку экстракта осадка Б с целью очистки от липопротеидов хлороформом и декстрансульфатом и последующее осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем (схема 1).

Недостатком способа является то, что конечный продукт содержит IgA - иммуноглобулин в количествах, недостаточных для достижения терапевтической эффективности при ряде заболеваний (заболевания желудочно-кишечного тракта, хронические инфекции дыхательных путей, кожи и т.д.) (≈ 15%), что ограничивает спектр его применения, кроме того, технологический процесс получения препарата достаточно трудоемок.

IgA-иммуноглобулин селективно проходит через железистые органы и, соединяясь с так называемым секреторным компонентом, в виде димера располагается на поверхности клеток слизистых оболочек. При попадании в секреты лишь значительного количества IgA-ИГ, он может обеспечить поверхностную защиту от целого ряда бактерий и вирусов.

Целью настоящего изобретения является способ получения иммуноглобулинового препарата с повышенным содержанием IgA и упрощение технологии производства препарата. Поставленная цель достигается за счет следующих приемов: в известном способе получения КИП после обработки экстракта осадка Б полиэтиленгликолем (10-15% от общего объема) осадок, содержащий иммуноглобулины и липопротеиды, растворяют в дистиллированной воде, центрифугируют и используют надосадочную жидкость в качестве IgA препарата. Осадок, содержащий эвглобулины (IgG, часть IgM и др.) и липопротеины удаляют, тем самым исключают одну из самых трудоемких стадий в известном способе - обработку хлороформом высокотоксичным реагентом и декстрансульфатом - дорогостоящим импортным реактивом (схема 2). Увеличение содержания в препарате IgA-ИГ расширяет спектр специфической терапевтической эффективности в отношении бактериальных и вирусных инфекций.

Препарат выпускают в сухом виде для применения per os и в жидком виде для в/м и в/в введения.

Лиофилизированный препарат предназначен для перорального применения для лечения ряда вирусных и бактериальных инфекций желудочно-кишечного тракта, особенно при некротизирующих энтероколитах у детей раннего возраста. В виде раствора препарат можно вводит в/с или в/в и при следующих показаниях.

1. Заболевания дыхательных путей (относительная иммунологическая недостаточность повышенная потребность в IgA), рецидивирующие респираторные инфекции, рецидивирующие тонзиллиты, отиты, синуситы, астматоидные бронхиты.

2. Заболевания желудочно-кишечного тракта (вторичная недостаточность), синдром потери белка и мальабсорбции, стеаторея.

3. Заболевания кожи, плохо поддающиеся лечению: пиодермии, экзема.

4. Синдром недостаточности антител (К.-Д. Тимпнер. Ф. Нойхаус, 1979).

Пример. 1 кг осадка Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия, центрифугируют в течение 1 часа при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Осадок удаляют. Объем полученного экстракта составляет 10 л.

К 10 л экстракта осадка Б добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля (м. м. 4-6 тыс.) до конечной концентрации 10-15% Осадок, содержащий липопротеины и иммуноглобулины, отделяют центрифугированием и растворяют в пятикратном объеме дистиллированной воды (200 г осадка в 1000 мл воды). После перемешивания полученную суспензию оставляют на 18 час при 4-6^oС. Осадок эвглобулинов отделяют центрифугированием и удаляют. Надосадочная жидкость - конечный продукт в объеме 1 л с содержанием белка 3-4% В готовый препарат добавляют глюкозу до концентрации 2% После осветляющей и стерилизующей фильтрации препарата лиофилизируют.

Количественное соотношение иммуноглобулинов в препарате: IgG-55-65% IgA-30-40% IgM-5% Титры антител представлены в таблице 1.

Cхема 1.

Осадок Б.

Экстрагирование в 0,15 М NaCl, рН 5,5, 1 кг осадка Б, 10 л 9% раствора NaCl.

Центрифугат.

Хлороформ 10% рН 5,5. Декстрансульфат 0,1%
Центрифугат.

Полиэтиленгликоль м.м. 6000. Насыщение 12%
Осадок.

Промывание дистиллированной водой, рН 5,2. Растворение в 0,15 М NaCl.

Центрифугат.

Глюкоза 2% рН 7,2. Осветляющая и стерилизующая фильтрация.

КИП.

IgG -65-70%
IgM -15-20%
IgA -15%
Cхема 2.

Осадок Б.

Экстрагирование в 0,9% растворе хлорида натрия.

Центрифугат.

Полиэтиленгликоль м.м. 4-6 тыс Насыщение 10-15%
Осадок удаляют.

Центрифугат.

Глюкоза 2% рН 7,2. Осветляющая и стерилизующая фильтрация.

IgA иммуноглобулин.

IgG -55-65%
IgA -30-40%
IgM 5%

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний. Цель изобретения - увеличение содержания в препарате IgA иммуноглобулина и упрощение технологии производства. Спиртовый осадок Б/Ш фракция Кона/ экстрагируют в десятикратном объеме раствора хлористого натрия для выделения фракции иммуноглобулинов, обрабатывают полиэтиленгликолем /10-15% от общего белка/. Осадок растворяют в дистиллированной воде, центрифугируют и используют надосадочную жидкость в качестве IgA-иммуноглобулинового препарата. Содержание IgA-ИГ при этом увеличивается на 30-40%, технологический цикл сокращается за счет удаления наиболее трудоемкой стадии. 1 табл.

Способ получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем солевой экстракция спиртового осадка сыворотки крови человека, отличающийся тем, что выделение фракции иммуноглобулинов проводят в присутствии 10 15% полиэтиленгликоля с последующим растворением осадка иммуноглобулинов в дистиллированной воде, отделением конечного продукта в виде надосадочной жидкости центрифугированием.