ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA ODORIFERA A 3n ГКМ ВИЗР № 99 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/425 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Известны аэробные нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 г., 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для удаления нефтяных загрязнений из объектов окружающей среды. Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, проявляя нефтеокисляющую активность в узком диапазоне температур.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИК₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИК_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при 10 - 40^oC, см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность при пониженной температуре окружающей среды.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой нефтеокисляющей активностью в широком диапазоне температур, в т.ч. при низкой температуре.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Serratia odorifera А 3n, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температуры окружающей среды ( 3 - 45^oC), в т.ч. при низкой температуре.

Штамм бактерий Serratia odorifera А 3n депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 99 от 12.03.99г.

Штамм бактерий Serratia odorifera А Зn выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы в Клайпедском филиале АО "ТОГ" поселка Кишкенай (Литовская республика) в 1998 году на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов, идентифицирован по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980 г.). Штамм подвергался селекции на нефтеокисляющую активность. С лучшими вариантами проводили эксперименты по оценке способности утилизировать углеводороды нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки штамма:
Культура не образует спор; факультативно аэробная, с дыхательным и ферментативным типом метаболизма; грам-отрицательная. В мазках из колоний, выросших на МПА через 24 ч, обнаруживаются подвижные с перитрихиальным жгутикованием палочковидные клетки размером (0,6-0,8) • (1,5-3,0) мкм. Клетки расположены одиночно или образуют цепочки, преимущественно короткие. Через 48 ч роста при 37^oC на МПА культура имеет непрозрачные матовые колонии с ровным краем. Культура хорошо снимается петлей с поверхности агара.

Минимальная температура роста Serratia odorifera А 3n колеблется в пределах 5 - 8^oC, максимальная - 41 - 45^oC, оптимальная - 26 - 40^oC; pH среды: минимальный - 4, максимальный - 8, оптимальный - 6 - 7. Для длительного хранения штамм консервируется в виде лиофилизированной культуры при (2 - 5)^oC.

Физиолого-биохимические признаки штамма:
Ферментирует глюкозу, маннозу, инозитол, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин, арабинозу. Дает отрицательный оксидазный, положительный каталазный тесты, положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Не продуцирует флюоресцирующий пигмент; не образует сероводород и индол; не разрушает уреазу и цитрат; гидролизует желатин; образует кислоту из целлобиозы; имеет лизин- и орнитиндекарбоксилазу; не имеет триптофандеаминазу; обладает нитратредуцирующей способностью.

Для выращивания указанного микроорганизма используется посевная и ферментационная питательные среды следующего состава, г/л:
KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeCl₃•6H₂О - 0,05
CaCl₂•2H₂O - 0,01
(NH₄)₂SO₄ - 2
Соевая мука - 5
Меласса - 20
Вода - До 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V=100 л при 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 ч в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01%-ную сырую нефть. Наполнителем служил стерильный торф. В качестве минеральных добавок использовали, мас.%:
Источник азота - карбамид - 0,6
Источник фосфора - двойной суперфосфат - 0,3
Источник калия - сульфат калия - 1,5
После внесения культуры микроорганизма и минеральных добавок в торф проводилось доращивание при 3^oC в течение 120 ч.

Титр полученного биопрепарата - 1 • 10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически на приборе АН-2 по динамике снижения количества углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы.

Пример 1. Биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia odorifera А 3n был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с различным pH от 4,0 до 8,5 и с содержанием мазута 21,4 - 23,2 г/кг. Количество внесенного биопрепарата - 1г на 1кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры 3 - 40^oC в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia odorifera А 3n был внесен в керамические сосуды, наполненные почвой с различным pH от 4,0 до 8,5, с содержанием сырой нефти 30,2 - 31,4 г/кг. Опыт проведен в трех повторностях. Результаты представлены в таблице 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 93,7%), в том числе и при низкой температуре (до 92,4% при 3^oC). При этом штамм эффективен в широком диапазоне pH 4 - 8,0.

Штамм бактерий Serratia odorifera А 3n может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Serratia odorifera A 3n выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован в ГКМ ВИЗР под номером 99. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, соевую муку, мелассу при 28^oС в течение 72 ч, в аэробных условиях. Наполнителем служит стерильный торф с минеральными добавками, доращивание проводили при 3^oC в течение 120 ч. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов при рабочей концентрации 0,1% составила 86,4 - 93,7% в широком диапазоне температур (3 - 40°С). 2 табл.

Штамм бактерий Serratia odorifera A 3n ГКМ ВИЗР 99 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.