ШТАММ БАКТЕРИЙ AСETOBACTER PASTERIANUS АБЗ-2 ГКМ ВИЗР N 102 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/02 

Изобретение относится к биотехнологии, экологии и может быть использовано в производстве биопрепаратов для биологической очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде.

Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИ К_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при pH от 4,5 до 8,5, см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F3/34 от 12.04.94 г.

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность в щелочных средах (при pH до 10).

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью в щелочных средах (при pH до 10).

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2, обладающий высокой окисляющей активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов при pH от 4,5 до 10,0.

Штамм бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2 депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 102 от 12.03.99г. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980г.).

Штамм бактерий Acetobacter pasterianus ABЗ-2 выделен из почвы, загрязненной нефтепродуктами в Клайпедском филиале АО "ТОГ", поселок Кишкенай (Литовская республика) в 1998 году, идентифицирован по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980 г.). Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм подвергся селекции на нефтеокисляющую активность. С лучшими вариантами проводили эксперименты по оценке способности утилизировать углеводороды нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки штамма:
В мазке, приготовленном из 24-часовой культуры, выросшей на МПА или СПА, обнаруживаются полиморфные палочки размером (0,6 - 0,8) х 0,8 х 2,0 мкм. Споры не образуются. Клетки расположены одиночно, иногда в коротких цепочках. На МПА культура образует кремовые колонии вязкой консистенции. Штамм растет в диапазоне температур от +5^oC до 40^oC, оптимальная температура роста (25 - 32)^oC, на среде с ацетатом как единственном источнике углерода, рН среды от 4,0 до 10,5, оптимальный 5,0 - 9,0. Штамм хранят на косяках МПА или СПА при температуре (2 - 5)^oC или в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Физиолого-биохимические признаки:
Грам-отрицательный (по щелочи), облигатный аэроб, с дыхательным метаболизмом. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный. Не продуцирует флюоресцирующий и другие пигменты. Окисляет этанол до уксусной кислоты при рН 4,5. Сероводород не образует. Обладает нитратредуктазой. Не гидролизует желатин. Обладает липолитической активностью, разрушает твин-80. Индол не образует, уреазу не разрушает. Аргинин дигидролаза, лизин декарбоксилаза, триптофандеаминаза отсутствуют. Орнитин декарбоксилаза отсутствует. Цитрат не утилизирует. Образует кислоту из лактата, но не газ. Не ферментирует сахара: глюкозу, маннозу, инозитол, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин, арабинозу. Утилизирует углеводороды. Растет на средах, содержащих в качестве источника азота нитраты, соли аммония, аминокислоты, пептон, растительные гидролизаты, соевую и кукурузную муку.

Для выращивания указанного микроорганизма использовали посевную и ферментационную питательные среды следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5 г/л
FeCl₃ • 6Н₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2Н₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода до 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Наполнителем служил стерильный торф. В качестве минеральных добавок использовали:
источник азота - карбамид - 0,6 мас.%;
источник фосфора - двойной суперфосфат - 0,3 мас.%;
источник калия - сульфат калия - 1,5 мас.%
После внесения культуры микроорганизма и минеральных добавок в торф проводили доращивание при Т = 3^oC в течение 120 часов.

Титр полученного биопрепарата- 1 х 10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2.

Пример 1
Биопрепарат на основе штамма бактерий Acetobacter pasterianus ABЗ-2 вносили в керамические сосуды, содержащие мазут в концентрации 29,5-34,2 г/кг, pH грунта колебалось от 4,5 до 10,0.

Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oC. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в Таблице 1.

Пример 2
Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2 был внесен в сосуды, наполненные почвой, содержащей сырую нефть в концентрации 35,8 - 36,7 г/кг; pH почвы колебалось от 4,5 до 10,0. Опыт проведен в трехкратной повторности.

Данные представлены в Таблице 2.

Проведенные опыты подтвердили весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 94,6%), в том числе в щелочных средах (до 91,3% при pH 10,0). При этом штамм эффективен в широком диапазоне температур (Т = 3 - 45^oC).

Штамм бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2 может быть получен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2 выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован в ГКМ ВИЗР под номером 102. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, соевую муку, мелассу, при 28°С в течение 72 ч в аэробных условиях. Глубинную культуру микроорганизма (10%) вносят в стерильный торф с минеральными добавками и проводят доращивание при 3°С в течение 120 ч. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов при рабочей концентрации 0,1% составила от 86,3 до 94,6% в широком диапазоне рН (рН 4,5-10,0). 2 табл.

Штамм бактерий Acetobacter pasterianus АБЗ-2 ГКМ ВИЗР 102 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.