СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ИЗОЛЯТОВ И ШТАММОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/68 C12N15/34 A61K39/187 

Способ дифференциации и идентификации изолятов и штаммов вируса африканской чумы свиней.

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано при диагностике болезни, определении типовой принадлежности возбудителя, разработке и применении вакцин путем идентификации и паспортизации вирулентных и вакцинных штаммов вируса африканской чумы свиней (АЧС) методом рестрикционного анализа.

Современные методы молекулярной биологии интенсивно используются для излучения структурно-функциональной организации генома различных ДНК-содержащих вирусов и их компонентов, в частности аденовирусов, герпесвирусов, осповирусов и вируса африканской чумы свиней. Однако эти методы, по доступным литературным данным, не используются для дифференциации и идентификации вирулентных и авирулентных изолятов вируса АЧС, а также паспортизации вакцинных штаммов.

Многообразие в антигенном и иммунологическом отношениях, наличие гемадсорбирующих и негемадсорбирующих штаммов вируса АЧС значительно усложняет постановку диагноза и идентификацию изолятов и штаммов вируса общепринятыми методами (клинико-эпизоотологические данные, патоморфологические изменения, реакция гемадсорбции (РГА) и задержки гемадсорбции (РЗГА), реакция диффузионной преципитации (РДП), что не позволяет быстро купировать болезнь и может привести к ее широкому распространению (Вишняков и др. Вопросы ветер. вирусол. и микробиол. 1992, 57 - 68; African swine fever. Ed.J.Becker, Boston, 1987). При определении типовой принадлежности различных штаммов и изолятов вируса АЧС с помощью серологических реакций (РГА, РЗГА, РДП) и оценке перекрестного иммунитета in vivo используются чувствительные животные (свиньи), культуры клеток костного мозга свиней и лейкоцитов крови свиней, что значительно удорожает стоимость этих работ и сопряжено затратами большого количества времени, особенно при использовании животных. Продолжительность диагностики возрастает до 10-30 дней. Кроме того, эти методы не позволяют различать варианты штаммов, близкие в антигенном отношении, незначительно отличающиеся своими биологическими свойствами и, следовательно, не могут быть использованы для эпизоотологического мониторинга и проведения контроля за генетической стабильностью вирулентных и вакцинных штаммов вируса АЧС (De la Vega et. al. , 1990, Virology, 1990, 179, p.234-246; Pan J.C. et al., Fed. Proc. 1984, v.43, N 7, p. 1939; Pan J.C. et al., Am.J.Vet. Res. 1988, v.46, N 2). Эти же недостатки относятся и к методам диагностики, основанным на выявлении специфических антигенных детерминант с помощью моноклональных антител, использования ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В литературе описано применение метода рестрикционного анализа для излучения структуры генома изолятов и штаммов вируса АЧС (Dixon L. and P.J.Wilkinson. J.Gen. Virol. 1988, 69, 2981 - 2993; Aguero M. et al. Virology, 1990, 176, 195 - 204; Blasco R. et al. Virology, 1989, 173, 251 - 257) и их классификации, основанной на анализе расположения Sal Gl сайтов рестрикции в центральной области генома (Blasco R. et. al. Virology, 1989, 168, 330 - 338). При этом использование одной рестриктазы Sal GI для анализа только центральной консервативной области генома, имеющей высокую степень гомологии, не позволяет дифференцировать изоляты и штаммы вируса, и поэтому, в данном случае, штаммы, имеющие различное происхождение и иммунобиологические свойства, были отнесены к одной группе.

Ближайшим аналогом изобретения является способ анализа генома изолятов расщеплением ДНК двумя среднещепящими рестриктазами (Bam HI и Cla I) с последующим разделением фрагментов в геле агарозы стандартным методом электрофореза. Этот способ позволяет определять более тонкие различия между изолятами и дифференцировать их, но при этом выявляемые различия столь значительны, что не представляется возможным определить групповую принадлежность изолятов и их эволюционное происхождение (Dixon L. and P.J.Wilkinson. J. Gen. Virol. 1988, 69, 2981-2993). Такое положение обусловлено тем, что в процессе эволюции в природе и адаптации вируса АЧС к различным культурам клеток его геном претерпевает точечные мутации и утрачивает различные участки ДНК вариабельных регионов, связанных с такими проявлениями фенотипа, как сродство к чувствительным клеткам, гемадсорбирующая активность, вирулентность, способность к продуктивному инфицированию клеток и иммунобиологические свойства. В разных областях генома подобные изменения происходят с различной частотой и поэтому определить точную локализацию подобных делеций и установить структуру этих областей невозможно при использовании только одной или даже двух рестриктаз.

Задачей изобретения является разработка более совершенного способа дифференциации полевых изолятов и идентификации вирулентных, авирулентных и вакцинных штаммов вируса АЧС методом рестрикционного анализа для диагностики болезни, определения генетического родства исследуемых изолятов с референс-штаммами основных серотипов вируса, повышения эффективности противоэпизоотических мероприятий и паспортизации производственных вакцинных штаммов.

Поставленная задача решается тем, что для дифференциации и идентификации изолятов и штаммов вируса африканской чумы свиней применяется расщепление вирионной ДНК набором эндонуклеаз рестрикции (BamHI, SalI, KpnI), разделение полученных фрагментов электрофорезом, а для разделения Kpn I - фрагментов пульс-электрофорезом в геле агарозы и сравнение профилей рестрикции с профиля известных штаммов, что позволяет анализировать структуру центральной, консервативной области, а также левого и правого концевых вариабельных участков генома, участвующих в рекомбинации, коррелирующих с гетерогенностью вирусной популяции и проявлением вирулентных свойств.

Пример конкретного выполнения.

В качестве исходной вируссодержащей суспензии используют не менее 300 - 500 мл инфицированной штаммом вируса АЧС (табл. 1) перевиваемой культуры клеток почти поросенка (ПП) или культуры лейкоцитов с титром инфекционности не ниже 7,5 lg ГАЕ 50/мл.

Вируссодержащую суспензию осветляют центрифугированием в течение 20 мин при 3000 об/мин и температуре +4^oC. Вирусные частицы из надосадочной жидкости осаждают повторным центрифугированием буфере pH 7,5 и 30 мин инкубируют с проназой E при 37^oC. Суспензию наслаивают на ступенчатый градиент сахарозы (35, 45, 50%) и центрифугируют при 25000 об/мин, температуре 5^oC в течение 2 ч. Фракцию очищенного вируса, расположенную на 45%-ной сахарозе, отбирают и вирус осаждают центрифугированием при 25000 об/мин в течение 60 мин. Осадок ресуспендируют в буфере STE и используют для выделения ДНК.

Из осадка вирусных частиц выделяют геномную ДНК фенольно-детергентным методом и проверяют методами электрофоретического и рестрикционного анализа. Количество вирусной ДНК в препаратах определяют окрашиванием гелей раствором этидиум бромида в концентрации 2 мкг/мл в течение 30 мин.

Испытуемые ДНК расщепляют каждой из 3-х эндонуклеаз рестрикции, специально подобранных для дифференциации штаммов вируса АЧС - Sal GI, Kpn I, Bam HI. Гидролиз ДНК рестриктазами проводят в течение 4 ч при 37^oC. Фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 0,7% гелях агарозы с применением трисборатного буферного раствора.

После расщепления ДНК рестриктазами образуется характерный для каждого изолята (штамма) дискретный набор фрагментов вирусной ДНК, соответствующий по размерам цельной ДНК вируса АЧС. Размеры фрагментов ДНК определяют на основании размеров и расстояния пробегов в геле агарозы маркерных фрагментов (ДНК фага лямбда, разрезанная Eco RI и Hind III).

Профили рестрикции выявляют по флуоресценции этидиум бромида, индуцированной проходящими лучами ультрафиолетового света на трансиллюминаторе и фотографируют.

Результаты рестрикционного и электрофоретического анализа фрагментов ДНК различных изолятов вируса АЧС приведены в табл. 2, 3, 4 и схеме 1.

Как видно из табл. 2, 3 и схемы 1 общий размер ДНК представленных штаммов, определенный по профилям рестрикции, варьирует от 164 до 194 т.п.о., а 2/3 числа фрагментов (для штаммов 1, 2 и 4 серотипов) имеют одинаковые размеры и расположены в центральной, консервативной области генома. Однако, несмотря на сходство расположения большей части фрагментов ДНК, каждый из штаммов имеет свой, отличающийся от других профиль рестрикции. Кроме того, профили рестрикции штаммов одной серогруппы или имеющих общее происхождение содержат группы фрагментов, размеры которых характерны только для данных групп и выявляемы с применением предлагаемого комплекса рестриктаз. Основные различия ДНК штаммов, обусловленные делециями и вставками участков ДНК, расположены вблизи правого и левого концов молекул. Причем авирулентные штаммы вируса АЧС в области левого конца генома имеют большие (до 15 т.п.о.) делеции. Левая концевая вариабельная область имеет один Kpn l сайт рестрикции и отщепляется от молекулы ДНК вируса АЧС в виде одного (до 56 т.п.о.) или двух (15 - 18 т.п.о. и 40 - 46 т.п.о.) высокомолекулярных фрагментов, которые трудно анализировать в условиях стандартного электрофореза, позволяющего разделять фрагменты нуклеиновых кислот размером до 30 т.п.о.

Для разделения Kpn l фрагментов применяют электрофорез в пульсирующем электрическом поле (пульс-электрофорез), позволяющий разделять высокомолекулярные фрагменты ДНК и определять их размеры.

Профили рестрикции и результаты расчитанных размеров фрагментов сравнивают с соответствующими характеристиками геномов референс-штаммов, принадлежащих к основным сероиммунотипам, представленным в табл. 1 4 и схемах распределения фрагментов. Оценивают сходство профилей рестрикции и наличие фрагментов, размеры которых характерны только для штаммов определенной серогруппы. Присутствие в профилях рестрикции характерных фрагментов указывает на генетическое родство и принадлежность исследуемой ДНК вируса к определенной серогруппе, а полное совпадение профилей рестрикции по трем рестриктазам (Sal GI, Kpn I, Bam HI) - на штамм данного вируса АЧС.

Таким образом, метод рестрикционного анализа с использованием набора эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Kpn I, Bam HI и дополнительного пульс-электрофореза позволяет дифференцировать изоляты и идентифицировать штаммы вируса АЧС, а также пригоден для паспортизации вирулентных референс-штаммов и вакцинных штаммов.

Приведенные в табл. 1 - 4 данные подтверждены актом комиссионных испытаний.

Технологическая и экономическая эффективность предложенного способа дифференциации и идентификации вирулентных, авирулентных изолятов и штаммов, а также контроля производственных штаммов вакцин достигается за счет сокращения (в 5 - 10 раз) сроков типирования возбудителя и снижения при этом в 10 раз затрат. Это значительно сокращает продолжительность постановки диагноза, установления источника заноса инфекции и проведения эффективных противоэпизоотических мероприятий. Кроме того, предлагаемый способ контроля генома производственных вакцинных штаммов является более технологичным, экономичным и может быть использован при промышленном производстве.

Способ предназначен для дифференциации и идентификации изолятов и штаммов вируса африканской чумы свиней. Способ включает выделение вирионной ДНК, расщепление вирионной ДНК рестриктазами Bam HI, SalI, KpnI, разделение полученных фрагментов электрофорезом в геле агарозы, сравнение профиля рестрикции с профилями известных штаммов. Для разделения KpnI - фрагментов дополнительно осуществляют пульс-электрофорез. Способ позволяет с высокой эффективностью дифференцировать и идентифицировать изоляты и штаммы вируса африканской чумы свиней. 1ил., 4 табл.

Способ дифференциации и идентификации изолятов и штаммов вируса африканской чумы свиней, включающий выделение вирионной ДНК, расщепление ее эндонуклеазами рестрикции, разделение полученных фрагментов электрофорезом в геле агарозы и сравнение профиля рестрикции с профилями известных штаммов, отличающийся тем, что расщепление вирионной ДНК осуществляют при использовании набора эндонуклеаз рестрикции BamHi, SalI, KpnI, а для разделения Kpn I-фрагментов дополнительно осуществляют пульс-электрофорез.