СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.

Африканская чума (АЧС) является наиболее опасной болезнью для свиней, способной привести к катастрофическим последствиям для свиноводства любой страны. Клинические признаки и патологоанатомические изменения имеют значительное сходство с симптомами, которые наблюдают при классической чуме свиней, поэтому при лабораторных исследованиях эти болезни всегда необходимо дифференцировать.

Известен способ выявления вируса классической чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров и полимеразной цепной реакции, включающий синтез синтетических олигонуклеотидов - праймеров в консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса классической чумы свиней, но имеющих наибольшие отличия от нуклеотидных последовательностей РНК штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, затем синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомянутых праймеров [1].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ и набор для обнаружения ДНК вируса АЧС методом ПЦР. При этом амплифицируют фрагмент ДНК размером 1144 пар нуклеотидов с праймерами N1 и N3 и фрагмент 562 пары нуклеотидов с праймерами N2 и N3, содержащий сайт для рестриктазы Pst I. Набор включает пластиковые пробирки, содержащие специфические праймеры (N1, N2, N3); фермент Tag-полимеразу; 10-кратный буфер для реакции, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов; положительный контроль - рекомбинатную плазмиду, содержащую ген белка Vp 72. Недостатком указанного способа и набора является необходимость специальной подготовки биологических проб и фенольно-детергентный метод выделения нуклеиновых кислот, при котором концентрация выхода нуклеиновой кислоты не постоянная и требует последующего ее разведения [2].

Целью изобретения является разработка более чувствительного и специфичного способа и соответствующей тест-системы для выявления генома вируса АЧС в пробах органов и образцах крови от больных животных.

Поставленная цель достигается способом для обнаружения ДНК вируса АЧС в пробах органов и образцах крови хронически инфицированных, больных и павших животных и в инфицированной культуре клеток, при котором для постановки ПЦР проводят денатурацию исследуемой ДНК при температуре 94°С, гибридизацию ДНК со специфическими праймерами, комплементарными высококонсервативной области генома вируса АЧС района гена Р30, имеющими следующий нуклеотидный состав:

P30F-5' - aga atg ggg atc cat tct gca tgt gct gtt tga - 3'

P30R - 5' - cta aaa atc cgg atg tag gtg aga tta aag ctt a - 3', с температурой отжига 55°C в течение 10-30 сек с числом циклов амплификации от 30-35, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта и тест-системой, включающей три набора с пластиковыми флаконами и пробирками:

1) набор для выделения нуклеиновых кислот, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата;

2) набор для постановки ПЦР, включающий специфические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома вируса АЧС района гена P30, имеющие следующий нуклеотидный состав:

P30F-5' - aga atg ggg atc cat tct gca tgt gct gtt tga - 3'

P30R-5' - cta aaa atc cgg atg tag gtg aga tta aag ctt a - 3'

термостабильный фермент Tag-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный контроль;

3) набор для проведения электрофореза, содержащий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.

Первый набор позволяет быстро и качественно выделить ДНК вируса АЧС без предварительной подготовки суспензии из органов и выделения форменных элементов из крови.

При постановке ПЦР во втором наборе производится многократное повторение циклов денатурации исследуемой кДНК при температуре 94°С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 55°С и синтеза из них комплементарных цепей ДНК с помощью стабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С и одновременная посадка праймеров, при этом исключается использование метилгидроксида ртути. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле (третий набор).

Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы в пробах органов и крови от больных животных.

При наличии в исследуемом образце генома вируса АЧС синтезируется фрагмент 374 п.о.

Установлено, что в процессе выделения происходит «стандартный» выход ДНК, что не требует предварительного многократного разведения нуклеиновой кислоты для постановки ПЦР.

Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа является то, что:

1. Не требуется предварительная подготовка проб. Т.е. на первом этапе метода выделения к биоматериалу добавляется лизирующий буфер (1:10) без предварительного приготовления суспензий из органов. Это влияет на уменьшение контаминации и значительно сокращается время проведения диагностической экспертизы.

2. При выделении ДНК вируса фенол заменен на гуанидинтиоционат, обладающий меньшей токсичностью.

3. В процессе выделения происходит «стандартный» выход ДНК, что не требует его дополнительного разведения перед постановкой ПЦР.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Тест-система снабжена пластиковыми флаконами и пробирками.

Пример 1. Выявление ДНК вируса АЧС, выращенного в культуре клеток (13 вирулентных и авирулентных штаммов) и проб биологического материала, полученного от больных животных.

В качестве отрицательного контроля использовали: вирус классической чумы свиней, вирус болезни Ауески и пробы органов здоровых свиней.

При использовании первого набора тест-системы в образец биологического материала (лимфатические узлы, селезенка, либо пула органов) добавляют (в соотношении 1:10) лизирующий буфер, содержащий гуанидинтиоционат, 1 М TrisHCl, тритон × 100, 0,5 ЭДТА. Смесь в течение 0,5 ч инкубируют при комнатной температуре, добавляют нуклеосорбент для сорбции ДНК, затем проводят отмывку сорбента, отмывочным буфером состоящим из гуанидинтиоционат, 1 М TrisHCl и воды от компонентов разрушенного вируса, после ДНК элюируют с сорбента бидистилированой водой. Выделенную ДНК используют в ПЦР.

При использовании 2-го набора проводят амплификацию участка ДНК (P30) вируса АЧС. Инкубационная смесь конечным объемом 25 мкл содержит: буфер для Tag-полимеразы с 15 mM MgCl₂, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 5 ед. фермента. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. Температурный режим проведения ПЦР показан в табл.1

Таблица 1. Процесс Температура Время Циклов Денатурация 94°С 3 мин 1 Денатурация 94°С 10 с   Отжиг 55°С 20 с 30 Элонгация 72°С 15 с   Элонгация 72°С 1 мин 1

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-борном буфере с использованием 3-го набора.

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (15 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 374 пар оснований.

С применением предлагаемой тест-системы выявления вирус АЧС детектируется во всех исследованных образцах вируса АЧС, выращенных как в культуре клеток, так и из проб органов.

Пример 2. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на ген P30

Специфичность метода ПЦР определяют амплификацией ДНК, выделенных из контрольных образцов по размеру синтезированного продукта ПЦР электрофорезом в геле агарозы.

Показана высокая специфичность предлагаемого способа при исследовании препаратов ДНК штаммов различных серотипов, отличающихся по вирулентности и способности к гемадсорбции.

Оценена пригодность применения разработанного способа для выявления ДНК вируса АЧС в пробах органов инфицированных животных. В опытах по обнаружению генома вируса АЧС были использованы препараты ДНК, выделенные из крови, селезенки, печени, лимфоузлов павших подсвинков, зараженных вирусом АЧС (штаммом Мадейра I серотипа); подсвинков, убитых через 21 день после иммунизации авирулентным штаммом МК-220 III серотипа (табл.2).

Высокая чувствительность способа позволила сделать вывод, что с помощью указанных праймеров можно выявлять животных с хроническим и бессимптомным течением болезни, когда титр инфекционности не превышает значений 1,5-2,5 lg ГАдЕ50/мл.

При использовании тест-системы ДНК-родственных и гетерологичных вирусов не обнаружено. Требования к тест-системе представлены в табл.3.

Таблица 3
Требования к Тест-системе Наименование показателя Характеристика и норма Чувствительность Должна амплифицировать геном вируса АЧС с титром 10 ТЦД₅₀/см³ Специфичность Не должна амплифицировать ДНК других бактерий и вирусов

В гель вносят маркер молекулярного веса, а оценку проведения реакции осуществляют по размеру продукта ПЦР, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру 374 пар оснований.

Таким образом, предлагаемые способ и тест-система позволяют достичь высокого уровня чувствительности с помощью 2-х праймеров вместо 3-х, используемых в стандартных ПЦР. Это позволяет в течение 3-х часов обнаружить 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни.

Тест-система для выявления вируса АЧС с помощью ПЦР рассчитана на 50 реакций.

Источники информации

1. Заявка RU 97103934, Пузырев А.Т., Донченко А.С., Орешкова С.Ф. и др., 1999 г.

2. Патент RU 2125089, Цыбанова Л.Я., Вишняков И.О., Цыбанов С.Ж., 1999 г.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики. Предложен способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, а также тест-система для обнаружения ДНК вируса АЧС. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 3 табл.

1. Способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, включающий выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции проводят при денатурации исследуемой ДНК при температуре 94°С с использованием синтезированных праймеров, амплификацию ДНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем, что выделение ДНК производят методом сорбции нуклеиновой кислоты с применением силикагеля при постановке полимеразной цепной реакции, гибридизацию ДНК со специфическими праймерами, комплементарными высококонсервативной области генома вируса АЧС района гена Р30 и не взаимодействующими с гетерологичными вирусами, имеющими следующий нуклеотидный состав:
P30F-5' - aga atg ggg atc cat tct gca tgt gct gtt tga - 3'
P30R-5' - cta aaa atc cgg atg tag gtg aga tta aag ctt a - 3'
с температурой отжига 55°С в течение 10-30 с с числом циклов амплификации от 30-35, затем проводят оценку результатов реакции методом электрофореза в агарозном геле без предварительной рестрикции полученного продукта.

2. Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: набор для выделения нуклеиновых кислот, содержащий нуклеосорбент с лизирующим буфером на основе гуанидинтиоционата; набор для постановки ПЦР со специфическими олигонуклеотидными праймерами, комплиментарными высококонсервативной области генома вируса АЧС района гена Р30 по п.1, имеющими следующий нуклеотидный состав:
P30F-5' - aga atg ggg atc cat tct gca tgt gct gtt tga - 3'
P30R-5' - cta aaa atc cgg atg tag gtg aga tta aag ctt a - 3'; набор для проведения электрофореза, содержащий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.