СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАНКА АУТОХТОННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к области микробиологии и медицины и может быть использовано для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника человека или животного.

Полный спектр нормальной кишечной микрофлоры является необходимым звеном во многих метаболических реакциях макроорганизма и, прежде всего, предотвращает развитие патогенных и условно патогенных микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте. Микрофлора участвует в осуществлении печеночно-кишечной циркуляции важнейших компонентов желчи; ферменты флоры в дистальной части кишечника инактивируют биологически активные соединения (биогенные амины), выделяющиеся организмом с пищеварительными соками; кишечная флора утилизирует непереваренные пищевые вещества с образованием аминов, органических кислот и других соединений, влияющих на обмен веществ в организме. Одной из важнейших функций нормальной кишечной микрофлоры является ее участие в формировании иммунологической реактивности макроорганизма. В результате антигенной стимуляции (аутофлорой), прежде всего кишечными бактериями, в организме создается общий пул иммуноглобулинов.

Известен способ профилактики дисбактериоза кишечника новорожденных детей, включающий введение ребенку через 30-120 мин после рождения орально, однократно штаммы бифидобактерий в дозе 10⁸ - 10⁹ микробных тел, полученных от матери (авт. св. 1743607, кл. А 61 К 35/74, опубл. 1992). Такая методика эффективна для профилактики дисбактериоза кишечника ребенка, рожденного путем кесарева сечения [1].

Однако для профилактики дисбактериоза используется не весь спектр здоровой микрофлоры кишечника, а только монокультура бифидобактерий. Кроме того, указанная культура бактерий не адаптирована к кишечнику ребенка, может там не прижиться, так как взята не из кишечника этого ребенка (т.е. не является аутоштаммом), вследствие чего данный метод профилактики недостаточно эффективен. При оральном введении бактерий часть их гибнет при прохождении различных отделов желудочно-кишечного тракта.

Известен способ получения и применения комплексного бактерийного препарата для коррекции дисбиоза кишечника, включающий выделение из организма человека и наработку биомассы аутоштамма лактобактерий или кишечной палочки с последующим соединением микроорганизма с основой. В качестве основы используют активированный уголь, поверхность частиц которого соединяют с микробными клетками в концентрации на 1 мм² 2,1•10³ - 10⁵. При этом активированный уголь используют в виде порошка с размером частиц менее 30 мкм. Полученный препарат вводят орально в организм человека три раза в течение нескольких суток в дозе (0,3-1,0)•10² микр. кл. /г (патент РФ 2017486, кл. А 61 К 31/00, опубл. 1994) [2].

Однако для профилактики дисбактериоза используется не весь спектр здоровой микрофлоры кишечника человека, а только монокультура лактобактерий или кишечной палочки, вследствие чего снижается эффективность профилактики дисбактериоза.

Известен способ лечения дисбактериоза кишечника человека, включающий отбор проб фекалий из организма, титрование исследуемого материала стерильным физиологическим раствором, засев его из различных разведений на питательные среды, идентификацию, отбор аутоштаммов нормальной кишечной микрофлоры, содержащей бифидо- и лактобактерии, раздельную наработку биомассы каждого вида бактерий с последующим их смешиванием, кратковременным хранением при температуре +4-7^oС и периодическим оральным введением смеси указанных аутоштаммов в кишечник человека в процессе лечения дисбактериоза после проведения антибиотикотерапии (авт.св. 1286212, кл. А 61 К 35/74, опубл. 1987) [3].

Однако для лечения дисбактериоза используется не весь спектр здоровой микрофлоры кишечника человека, а только аутоштаммы бифидо- и лактобактерий, вследствие чего снижается эффективность лечения дисбактериоза. Кроме того, отбор аутоштаммов производится перед проведением антибиотикотерапии, когда нормальная часть (здоровая) микрофлоры человека находится в угнетенном состоянии. При оральном введении бактерий часть их гибнет при прохождении различных отделов желудочно-кишечного тракта, что также снижает эффективность лечения дисбактериоза и увеличивает сроки выздоровления организма.

Из источников научно-технической и патентной информации не известна постановка задачи, связанная с созданием и использованием банка аутохтонных штаммов микроорганизмов для восстановления кишечного микробиоценоза человека.

Таким образом, разработка способа получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов для восстановления кишечного микробиоценоза человека является новой задачей, а ее решение, предлагаемое в настоящих материалах заявки, не известно из современного уровня техники (за исключением способов отбора и кратковременного хранения отдельных видов аутоштаммов микроорганизмов, преимущественно бифидо- и/или лактобактерий [2,3] для лечения дисбактериозов различной этиологии), не имеет прототипа и соответствует всем критериям охраноспособности изобретения.

Задачей предлагаемого изобретения является создание впервые способа получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов, который позволил бы получать более стойкий и выраженный лечебно-профилактический эффект при его применении путем одновременного воздействия на различные звенья нарушенного бактериоценоза кишечника человека за счет использования более полного спектра нормальной (здоровой) аутохтонной микрофлоры кишечника.

Указанная задача решается тем, что в способе получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов для восстановления кишечного микробиоценоза человека, согласно изобретению, производят отбор проб фекалий из одного и того же организма в период его клинически здорового состояния, начиная с 7-15 дня после рождения и в течение всей жизни периодически не чаще 1 раза в год, из проб выделяют и идентифицируют аутоштаммы нормальной кишечной микрофлоры, биомассу каждого вида бактерий раздельно нарабатывают на селективных питательных средах до титра не менее 10³ - 10⁹ кл/мл, полученные биомассы объединяют и добавляют стабилизирующий состав, полученную смесь разделяют на образцы, каждый из которых консервируют, хранят в течение жизни человека с периодическим контролем биотитра.

После 7-15 дня после рождения человека заканчивается формирование его кишечной микрофлоры. Использование банка аутохтонных штаммов микроорганизмов, включающего весь спектр нормальной кишечной аутомикрофлоры человека, обеспечивает комплексное биологическое действие (при введении смеси штаммов в кишечник), направленное на ускорение нормализации микробиоценоза.

В грудном возрасте до 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis и лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti.

В возрасте старше 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus plantarum, штаммы бактерий Escherichia coli и молочнокислые стрептококки преимущественно вида Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus avium, Streptococcus salivarius и Streptococcus bovis.

Для создания банка аутохтонных штаммов микроорганизмов необходимо иметь образцы штаммов разного периода жизни человека для получения препаратов более широкого спектра и комплексного действия.

Объединение биомассы аутоштаммов каждого вида осуществляют в равных соотношениях. При этом обеспечивается снижение потерь биологической активности отдельных штаммов в смеси в процессе консервации и хранения.

В качестве стабилизирующего состава используют сахарозо-желатиновую или сахарозо-крахмальную защитную среду в количестве 5-10 мас.% от биомассы смеси аутоштаммов. При снижении концентрации стабилизатора в биомассе значительно увеличиваются потери биологической активности в процессе ее сушки и при последующем хранении.

Консервацию полученных образцов смеси аутоштаммов производят лиофилизацией.

В процессе хранения после контроля биотитра дополнительно объединяют в равных соотношениях часть образцов аутоштаммов бактерий, выделенных из нормальной кишечной микрофлоры человека в разные периоды его жизни, вследствие чего повышается биологическая активность препарата и приживляемость аутобактерий в кишечнике человека.

Использование всего спектра нормальной (здоровой) аутохтонной микрофлоры кишечника позволяет воздействовать на различные звенья нарушенного бактериоценоза кишечника в процессе лечения дисбактериоза или предотвратить нарушения бактериоценоза кишечника при профилактике указанного заболевания.

Технология приготовления банка образцов аутохтонных штаммов микроорганизмов приведена в примерах 1-4.

Пример 1. Для формирования банка аутохтонных штаммов микроорганизмов отбирают пробы фекалий человека не ранее чем на 7-15 день после его рождения. Исследуемый материал титруют стерильным физиологическим раствором, делая последовательно десятикратные разведения до 10^-8. Из различных разведений указанный материал засевают на питательные среды Блаурокка, Сабура, Эндо, Калины, МРС-4, кровяной агар с полимиксином для определения исходных уровней кишечных палочек, лактобактерий, бифидобактерий, энтерококков, стафилококков и других бактерий с последующей идентификацией и отбором аутоштаммов нормальной кишечной микрофлоры, соответствующей грудному возрасту ребенка и содержащей бифидо- и лактобактерии. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti), выросших на среде МРС-4, а также из изолированных колоний бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis), выросших на среде Блаурокка, вновь пересевают на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через двое суток после второго пассажа изолированные колонии бифидо- и лактобактерий пересевают (раздельно) соответственно на вышеуказанные питательные среды Блаурокка, МРС-4 и культивируют по стандартным методикам для получения биомассы микроорганизмов. Например, биомасса бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis ) имеет титр не менее 10⁹ кл/мл, биомасса лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti) - 10⁹ - 10¹⁰ кл/мл. Далее биомассу каждого вида аутохтонных штаммов микроорганизмов вводят в равных соотношениях в реактор и перемешивают для получения смеси. В полученную смесь добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду (стабилизирующий состав) в количестве 5-10 % от объема смеси биомассы. Биомассу аутоштаммов разливают в ампулы и сушат стандартным методом лиофилизации с последующей герметизацией и хранением при температуре не выше минус 18^oС для обеспечения сохранения активности препарата в течение длительного периода времени, например в течение периода жизни человека. Периодически (не реже 1 раза в год) контролируют (проверяют) биотитр одного или нескольких образцов банка аутоштаммов микроорганизмов путем пассажей на селективных питательных средах смеси аутоштамов и титрования стандартным методом каждого штамма. В случае снижения биотитра находящегося на хранении препарата весь объем сухой биомассы активируют путем пассажей на дифференцированной питательной среде до максимального увеличения биотитра. Далее в биомассу добавляют стабилизатор, разливают в ампулы и сушат методом лиофилизации и продолжают хранить при температуре не выше минус 18^oС.

Пример 2. Следующий отбор проб фекалий у этого же человека производят в возрасте 1-2 лет, т.е. после его грудного вскармливания, а затем в возрасте 4-5 лет и т. д. в течение всей жизни. Технология получения смеси биомассы аутоштаммов микроорганизмов аналогична примеру 1. Отличием является лишь то, что видовой состав нормальной кишечной микрофлоры у детей с увеличением возраста и у взрослых людей изменяется и стабилизируется численность представителей главной флоры - бифидобактерий на уровне 10⁸ - 10¹¹ микробных клеток в 1 г испражнений. Преобладающие у детей раннего возраста виды B. bifidum, B. brevis, B. infantis и другие вытесняются более распространенными у детей старшего возраста и взрослых видами: B. longum, B. adolescentis и др.

Исследуемый материал титруют стерильным физиологическим раствором, делая последовательно десятикратные разведения до 10^-8. Из различных разведений указанный материал засевают на питательные среды Блаурокка, Сабура, Эндо, Калины, МРС-4, кровяной агар с полимиксином для определения исходных уровней кишечных палочек, лактобактерий, бифидобактерий, энтерококков, стафилококков и других бактерий с последующей идентификацией и отбором аутоштаммов нормальной кишечной микрофлоры, содержащей бифидо- и лактобактерии, кишечные палочки, молочнокислые стрептококки, молочнокислые палочки. Через двое суток материал, например из изолированных колоний лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus plantarum), выросших на среде МРС-4, из изолированных колоний бифидобактерий (Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis), выросших на среде Блаурокка, из изолированных колоний энтерококков (Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus avium, Streptococcus salivarius и Streptococcus bovis), выросших на среде Калина, из изолированных колоний Escherichia coli (кишечная палочка), выросшей на кровяном агаре с полимиксином, вновь пересевают на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через двое суток после второго пассажа изолированные колонии бифидо- и лактобактерий, энтерококков, кишечных палочек пересевают (раздельно) соответственно на вышеуказанные питательные среды Блаурокка, МРС-4, Калина, кровяной агар с полимиксином и культивируют по стандартным методикам для получения биомассы микроорганизмов. Например, биомасса бифидобактерий имеет титр не менее 10⁹ кл/мл, биомасса лактобактерий 10⁹ - 10¹⁰ кл/мл, биомасса Escherichia coli не менее 10⁷ - 10⁸ кл/мл, а биомасса Streptococcus faecium - не менее 10⁹ кл/мл. Далее биомассу каждого вида аутохтонных штаммов микроорганизмов вводят в равных соотношениях в реактор и перемешивают для получения смеси. В качестве стабилизирующего состава может быть использована сахарозо-крахмальная защитная среда, которую вводят в биомассу аутоштаммов в количестве 5-10% от объема последней. Методы консервации, хранения и контроля биотитра смеси аутоштаммов аналогичны примеру 1. Образцы смеси аутоштаммов также хранят в течение всей жизни этого человека.

Пример 3. Дополнительно у этого же человека периодически (не чаще 1 раза в год) производят отбор проб фекалий в более старшем возрасте (в возрасте 30-45 лет и старше) в период его клинически здорового состояния и нормального функционирования кишечника. Технология получения образцов смеси биомассы данных аутоштаммов микроорганизмов и методы их консервации и хранения аналогичны примерам 1 и 2. Образцы смеси аутоштаммов микроорганизмов, полученные в примере 3, также хранятся в течение жизни человека.

Пример 4. В процессе хранения после контроля биотитра дополнительно объединяют в равных соотношениях часть образцов аутоштаммов бактерий, выделенных из нормальной кишечной микрофлоры человека в разные периоды его жизни и приготовленных в соответствии с примерами 1, 2 или 2, 3 или 1-3, вследствие чего повышается биологическая активность смеси вновь полученных образцов аутоштаммов микроорганизмов и приживляемость аутобактерий в кишечнике человека.

Совокупность хранимых образцов препаратов, полученных в соответствии с примерами 1-4, представляет собой банк аутохтонных штаммов микроорганизмов, используемый для восстановления кишечного микробиоценоза человека.

Способы применения банка образцов аутохтонного препарата приведены в примерах 5 и 6.

Пример 5. Для профилактики или лечения дисбактериозов одну из ампул с образцом смеси аутоштаммов, полученным, например, по примерам 1-3, вскрывают, смесь аутоштаммов активируют путем пассажей на дифференцированной питательной среде. Пассирование аутоштамов прекращают в логарифмической фазе роста не ранее 7 ч после их инокуляции на дифференцированную питательную среду. Далее активированный препарат в жидкой форме вводят в организм ректально в область прямой кишки при помощи зонда в дозе не менее 10⁵ - 10⁷ каждого вида микробных кл. на 1 кг массы тела в течение 2-3 дней. При этом препарат, содержащий аутохтонные штаммы нормальной кишечной микрофлоры, минуя желудок непосредственно попадает в кишечник человека, вследствие чего предотвращается снижение его биотитра.

Пример 6. Для лечения дисбактериоза кишечника человека, например после проведения антибиотиокотерапии, лучевой терапии и т.п., когда происходит полное или частичное уничтожение его нормальной кишечной микрофлоры, берут образец аутоштаммов, полученный по примеру 4 из кишечника организма в разные периоды жизни человека. Пассирование аутоштаммов прекращают в логарифмической фазе роста не ранее 7 ч после их инокуляции на дифференцированную питательную среду. Далее активированный препарат в жидкой форме вводят в организм ректально в область прямой кишки при помощи зонда в дозе не менее 10⁷ - 10⁹ каждого вида микробных кл. на 1 кг массы тела в течение 4-5 дней. При этом препарат, содержащий аутохтонные штаммы нормальной кишечной микрофлоры, минуя желудок, непосредственно попадает в кишечник человека, вследствие чего предотвращается снижение его биотитра.

Повышение эффективности предлагаемого способа профилактики и лечения дисбактериозов по сравнению с известными аналогами состоит в одновременном его воздействии на различные звенья нарушенного бактериоценоза кишечника за счет использования более полного спектра нормальной (здоровой) аутохтонной микрофлоры кишечника, вводимой ректально в кишечник человека.

Предлагаемый способ обеспечивает комплексное биологическое действие, направленное на ускорение нормализации микробиоценоза, ускорение восстановления морфологической структуры слизистой оболочки и клеточных факторов местного иммунитета, коррекцию иммунобиологической реактивности и ряд показателей гомеостаза, повышение неспецифической резистентности к неблагоприятным медикаментозным, алиментарным, экологическим, инфекционным и прочим воздействиям.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине и микробиологии.

Изобретение предназначено для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника человека. Способ включает отбор проб фекалий из одного и того же организма в период его клинически здорового состояния, начиная с 7-15 дня после рождения и в течение всей жизни периодически не чаще 1 раза в год. Из проб выделяют и идентифицируют аутоштаммы нормальной кишечной микрофлоры. Биомассу каждого вида бактерий раздельно нарабатывают на селективных питательных средах до титра не менее 10³ -10⁹ кл/мл. Полученные биомассы объединяют и добавляют стабилизирующий состав. Смесь разделяют на образцы. Каждый образец консервируют и хранят в течение жизни человека с периодическим контролем биотитра. В грудном возрасте до 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis и лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti. В возрасте старше 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus Plantarum, штаммы бактерий Escherichia coli и молочнокислые стрептококки преимущественно вида Streptococcus faccium, Streptococcus faecalis, Streptococcus avium, Streptococcus salivarius и Streptococcus bovis. В процессе хранения после контроля биотитра дополнительно объединяют в равных соотношениях часть образцов аутоштаммов бактерий, выделенных из нормальной кишечной микрофлоры человека в разные периоды его жизни. Введение в кишечник человека образцов банка аутошаммов микроорганизмов позволяет одновременно воздействовать на различные звенья нарушенного бактериоценоза кишечника за счет использования более полного спектра нормальной микрофлоры кишечника. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов для восстановления кишечного микробиоценоза человека, отличающийся тем, что производят отбор проб фекалий из одного и того же организма в период его клинически здорового состояния начиная с 7 - 15 дня после рождения и в течение всей жизни периодически не чаще 1 раза в год, из проб выделяют и идентифицируют аутоштаммы нормальной кишечной микрофлоры, биомассу каждого вида бактерий раздельно нарабатывают на селективных питательных средах до титра не менее 10³ - 10⁹ кл/мл, полученные биомассы объединяют и добавляют стабилизирующий состав, полученную смесь разделяют на образцы, каждый из которых консервируют, и хранят в течение жизни человека с периодическим контролем биотитра. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в грудном возрасте до 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis и лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в возрасте старше 1 года в качестве нормальной кишечной микрофлоры выделяют преимущественно бифидобактерии вида Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus plantarum, штаммы бактерий Escherichia coli и молочнокислые стрептококки преимущественно вида Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus avium, Streptococcus salivarius и Streptococcus bovis. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что объединение биомассы аутоштаммов каждого вида осуществляют в равных соотношениях. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизирующего состава используют сахарозо-желатиновую или сахарозо-крахмальную защитную среду в количестве 5 - 10 мас.% от биомассы смеси аутоштаммов. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что консервацию полученных образцов смеси аутоштаммов производят лиофилизацией. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе хранения после контроля биотитра дополнительно объединяют в равных соотношениях часть образцов аутоштаммов бактерий, выделенных из нормальной кишечной микрофлоры человека в разные периоды его жизни.