Способ получения водорастворимых антигенов из опухолевых тканей Советский патент 1992 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и касается оценки состояния клеточно-опосредо- ванного иммунитета у человека, может найти применение в онкологии для диагностики активности опухолевого процесса, а также для прогнозирования и определения эффективности противоопухолевой терапии, для изучения физико-химических и биологических свойств антигенов опухолей.

Цель изобретения - увеличение выхода, активности целевого продукта и сокращение времени его получения.

Способ осуществляют следующим образом.

Биопсийный материал опухоли получают на операции, опухолевую ткань замораживают и хранят при -20°С. Все препаративные работы, связанные с получением активного целевого продукта проводят при+4°С.

Образец ткани размораживают, взвешивают и гомогенизируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия, рН

4,5-5,0. Гомогенат фильтруют через капроновую сетку. Фильтрат охлаждают до 2-3°С и при рН 4,5-5,0 постепенно по мере растворения с помощью мешалки добавляют сухую навеску хлористого калия до конечной концентрации его в фильтрате 3 М.Экстракцию проводят при 3--5°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 15-17 ч. Материал подвергают ультрацентрифугированию. Проводят очистку полученного супернатанта от хлористого калия и балластных веществ ММ ниже 50 кд на колонке с сефадексом G-75, элюцию осуществляют дистиллированной водой. В качестве целевого продукта берут фракции свободного объема с ММ свыше 50 кд. Лио- филизируют их.

Пример 1. 0,4 г опухолевой ткани ретинобластомы, полученной после энуклеации пораженного глаза, гомогенизируют в 0,9% физиологическом растворе хлористого натрия с рН 4,5 в соотношении вес: объем 1:9 (г на мл). Полученный гомогенат фильтруют через капроновую сетку, в фильтрат

Ё

VI

4 х|

О VI С

объемом 4 мл с рН 4,9 по мере растзорения при постоянном перемешивании вносят сухой KCI до конечной его концентрации 3 М (0,89 г KCI), оставляют при постоянном перемешивании на 16 ч при 4°С. Затем фильтрат центрифугируют при 30000 об/мин 1 ч при 4°С. Супернатант подвергают очистке на колонке с сефадексом G-75 (4x15 см), удаляют хлористый калий и растворимый материал с ММ ниже 50 кд, элюцию проводят дистиллированной водой. Материал, проявляющий диагностическую активность в тесте торможения миграции лейкоцитов, собирают во фракциях внешнего объема колонки в области ММ выше 50 кд. До 95% материала в препарате имеет ММ 60-70 кд.

П р и м е р 2. Все процедуры выполняют, как в примерах 1 за исключением того, что источником препарата служит смесь Сио- псийного материала ткани ретинобласто- мы, полученной от нескольких больных. Экстракцию проводят при рН 4,5. Выделяют целевой продукт на колонке с сефадексом G-75. Проводят анализ материала методом высокоэффективной хроматографии на колонке с СК 3000 SW. Доля оптической плотности материала с ММ 60-70 кд составляет 68% от общего спектра оптической плотности материала, выделенного предлагаемым методом.

П р и м е р 3. Все процедуры выполняют, как в примере 1 за исключением того, что препарат получают мз ткани меланомы кожи. Выделяют фракцию с ММ более 50 кд после хроматографии на колонке с сефадексом G-75. Проводят анализ ММ препарата. Основное содержание препарата составляет фракция с ММ около 70 кд до 85%. Активность препарата определяют в тесте миграции лейкоцитов у больных с ме- ланомой кожи до лечения: индекс миграции 85 ±5%. Оптимальная концентрация препарата по белку 200-400 мкг/мл. В группах контрольных доноров ИМ был выше или равен 100%: здоровые

доноры 105 ±4,5% ,с другими опухолями 106 ±6,8%, с неонкологическими-заболеваниями 109,8± 10,2%

П р и м е р 4, Все процедуры выполняют

аналогично за исключением того, что препарат выделяют их опухолевой ткани адено- карциномы яичника. Основное содержание препарата составляет фракция 50-100 кд около 75%. Препарат проявляет специфическую иммунологическую активность в тесте миграции лейкоцитов при испытании в группе больных с аденокарциномой яичника. Оптимальная концентрация препарата по белку 200-400 мкг/мл.

Предлагаемый способ получения водорастворимых антигенных препаратов из опухолевой ткани позволяет увеличить выход препарата по белку в 30 раз, повысить биологическую активность в 10 раз в отличие от прототипа, получать иммунологиче- ски активн ie нетоксичные препараты с ММ в области 50-100 кд., обладающие диагностической ценностью в клеточных тестах, а также уменьшить затрачиваемой рабочее

время в 3 раза (с 6-7 сут по прототипу до 2-3 сут при использовании предлагаемого способа) за счет ликвидации стадии обессоли- вания и последующего концентрирования, что предотвращает частичную потерю эктивного материала до 20-30%.

Формула изобретения Способ получения водорастворимых антигенов из опухолевой ткани путем ее гомогенизации, подкисления до рН 4,5-5,0, фильтрации, охлаждения, добавления хлористого калия до 3 м, центрифугирования, гель-хроматографии и элюции целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью

увеличения выхода, активности целевого продукта и интенсификации способа, гомогенизацию ткани проводят одновременно с подкислением, а гель-хроматографию - на сефадексе G 75 с элюцией целевого продукта дистиллированной водой.

Изобретение относится к медицине точнее к клинической иммунологии. Цель изобретения - увеличение выхода активности целевого продукта и сокращение времени его получения. Для этого опухолевую ткань гомогенизируют и одновременно подкисляют, фильтруют, охлаждают, добавляют хлористый калий, хроматографируют на G-75 с элюцией целевого продукта дистиллированной водой.