Способ оценки лечения ретинобластомы у детей Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкоофтальмологии, и может быть использовано для оценки эффективности проводимого лечения, прогнозирования процесса развития ретинобластомы, оценки активности клеточного противоопухолевого иммунитета, достижения клинико-иммунологической ремиссии.

Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение точности способа.

Оценивают функциональную активность Т-лимфоцитов в тесте торможения миграции лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенных препаратов, содержащих полипептиды с мол.м. 50-100 КД. получаемых из ткани ретинобластомы и обладающих специфической активностью в отношении лимфоцитов периферической крови больных с ретинобластомой. Метод отличается простотой, требует 3-5 мл крови.

Способ осуществляют следующим образом.

В тесте торможения миграции лейкоцитов определяют миграционную способность лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенного препарата из ткани ретинобластомы. Рассчитывают индекс миграции (ИМ) лейкоцитов в процентах. При значениях ИМ выше 95% делают вывод о положительном эффекте проведенного лечения через 4-6 мес. после него и о благоприятном прогнозе течения заболевания.

I

О

со

о

При значениях ИМ ниже 95% делают вывод о недостаточной эффективности проведенной терапии спустя 4-6 мес и неблагоприятном прогнозе, а в случае клинической ремиссии - о повышенном риске рецидива заболевания.

Антигенный препарат для диагностики получают следующим способом.

Ткань ретинобластомы, полученную в результате энуклеации и хранящуюся при - 20°С, размораживают, взвешивают и гомогенизируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия при рН 4,5 в весовом соотношении ткань: раствор 1:9. Гомогенат фильтруют через капроновую сетку. Фильтрат охлаждают до 2-3°С, определяют обьем и при рН 4,5-5,0, добавляют хлористый калий, постоянно перемешивая, до конечной его концентрации в фильтрате 3 М. Экстракцию проводят в течение 16 ч при 4°С в условиях постоянного перемешивания на магнитной мешалке. Материал центрифугируют при 20000 об/мин 30 мин при 4°С. Из полученного супернатанта на колонке с сефадексом G-75 удаляют хлористый калий и балластные вещества с мол.м. ниже 50000 Д, не обладающие диагностической активностью. На колонку размером 4,0x15 см наносят 4-5 мл образца, элюцию проводят дистиллированной водой. Фракции свободного обьема с мол.м. свыше 50000 Д объединяют и лиофилизируют. Препарат используют в тесте миграции лейкоцитов в агаровых блоках в концентрации 100-200 мкг/мл по белку.

Тест торможения миграции лейкоцитов проводят следующим способом. Готовят 3%-ный агар Дифко в 0,05 М трис-НС1 буферном растворе, содержащем 0,9% NaCI. рН 7,3. Один обьем 3%-ного агара при смешивают с двумя объемами 199 среды, содержашей 1,5% сыворотки IV группы крови человека, и заливают в пластиковые чашки до высоты слоя агара А мм. После застывания агара чашки ставят в эксикатор с влажной атмосферой и 5%-ным содержанием С02. Эксикатор выдерживают при 4СС не менее 2 ч. В агаровых блоках пробойником диаметром 3 мм вырезают лунки (три для контроля без антигена и по три для проб с антигеном). Агаровые блоки до постановки реакции хранят во влажной камере с 5%-ным содержанием С02 при 4°С. Венозную кровь берут в пробирки с 0.5 мл 2.7%-ного раствора трилона В по 4-5 мм от каждого больного. После оседания эритроцитов отбирают плазму, обогащенную лейкоцитами, центрифугируют ее при 1200 об/мин. Осадок лейкоцитов дважды отмывают раствором Хенкса, не

содержащим ионов кальция и магния, в том же режиме. Доводят концентрацию лейкоцитов до 2,5х107 и вносят суспензию в лунки по 10 мкл. Затем в контрольные лунки

вносят по 10 мл раствора Хенкса, а в рабочие лунки - по 10 мкл раствора диагностического антигена - препарата из ткани ретинобластомы, содержащего 100-200 мкг белка в 1 мл раствора Хенкса. Чашки с лейкоцитами в агаровых блоках помещают в эксикатор с влажной атмосферой и 5%-ным содержанием СОз. Эксикатор помещают в термостат при 37°С на 17ч. После инкубации в чашки с агаром заливают 10%-ный

раствор формальдегида на 1 ч для фиксирования клеток. Формалин сливают, агар подсушивают до исчезновения влаги в лунках, затем его удаляют. Проводят оценку результатов реакции. Определяют среднюю ширину зон миграции лейкоцитов в контрольных лунках Ц и в лунках с антигеном La. как расстояние от границы лунки до края зоны миграции. Рассчитывают ИМ лейкоцитов по формуле

ИМ- -Х100%.

П р и м е р 1. Больная 1986 г.рожд, Диагноз - двухсторонняя ретинобластома. Левый глаз (худший) удален, диагноз подтвержден гистологически. Проводят орга- ноохранное лечение правого (0-Д-) глаза путем хймиолучевой терапии. 20.01.88 г. определяют путем эхографии степень проми- ненции (СП), она равна 5.0 мм и площадь

свежей опухолевой ткани на глазном дне офтальмоскопически, она равна 25%. У больной берут 4 мл венозной крови в пробирку с 0,5 мл 2.7%-ного раствора трилона Б, рН 7,3. Кровь отстаивают 40 мин. после

оседания эритроцитов отбирают плазму, центрифугируют ее при 1200 об/мин в течение 5 мин, осадок клеток ресуспендиру- ют в растворе Хенкса без кальция и магния рН 7:3, дважды переосаждают в том же

режиме центрифугирования. Осадок клеток ресуспендируют в 2 мл раствора Хенксэ и с помощью камеры Горяева подсчитывают концентрацию и общее количество выделенных лейкоцитов 7,8х10б.

Суспензию центрифугируют в том же режиме, осадок клеток ресуспендируют в 0.3 мл раствора Хенкса для получения концентрации клеток2.5хЮ в 1 мл. В лунки заранее приготовленных агаровых блоков с

1%-ным содержанием агара Дифко и 1%-ной сывороткой IV группы крови человека в 199 среде вносят по 10 мкл суспензии лейкоцитов, т.е. по 2,5хЮ5 клеток в каждую лунку. В три контрольные лунки

рносяч по 10 раствора Хснксэ. R три другие лунки той же чашки, вносят по 10 мкл раствора антигенного препарата из ткзни ретинобластомы в концентрации по белку 100 мкг/мл в растворе Хенкса. выделенного указанным способом. Инкубацию проводят при 37°С во влажной камере с 5%-ным содержанием СОа в течение 17-21 ч в трех чашках. Реакцию останавливают через 17, 19 и 21 ч от начала инкубации в чашках 1,2 и 3.10%-ным раствором формальдегида, заливая его по 2 мл в каждую чашку, диаметром 3.5 см. Фиксацию проводят 1 ч. Формальдегид сливают, агар подсушивают и удаляют. С помощью бинокулярного микроскопа определяют средние значения ширины зон миграции лейкоцитов в контроле без антигена и в опыте - с антигеном. Вычисляют ИМ лейкоцитов, который равен 85%. что указывает на угнетение миграционной активности лейкоцитов и отражает наличие жизнеспособной опухолевой ткани у больной. Проводят больной лечение в сочетании с иммунокоррекцией, за 1 день до курса лечения снова оценивают СП, она равна 4,0 мм и площадь живой опухолевой ткани (Пл). она равна 15%. а также берут венозную кровь в количестве Л мл и вновь оценивают миграционную активность лейкоцитов с помощью антигенного препарата из ткани ретинобластомы. как указано. Вычисляют ИМ-85%. Повторяют исследование через день после пяти дневного курса лечения: . СП 4,0, ИМ 85-86% (13,04.88). Обследование проводят через б мес после лечения 12.10.88: ,5 мм Пл- 8.5%, . Размеры опухоли (живой ткани) уменьшаются, ИМ возрастает. Далее через 9 мес (19.01.89) проводят обследование: мм. Пл 5%-рубцовэя ткань. Живой опухолевой ткани не обнаруживается, ИМ в норме. Отдаленные клинические результаты через 5 мес (06.06.89): плотный рубец, ремиссия, положительный эФФект от проведенной терапии, благоприятный прогноз.

Значения ИМ. определяемые предлагаемым способом, а также значения степени проминенции. в мм. и площади опухоли, в %. от площади сетчатки (СП и Пл/ обработаны статистически. Достоьер о ть раэпичий показателей в группах оценена по непараметрическому критерию Угпкоксона-Ман- на-Уитни. Обследовано 23 ребенка. Исходные показатели ИМ в острый период заболевания при наличии активной опухолевой ткани были 89 ± 2%. Детям проводили стандартную противоопухолевую терапию, а затем при отсутствии явного клинического эффекта провели курс иммунотерапии с тзктивин м. Вес дети были обследованы до лечения тзктивином после стандартной терапии, через день после курса лечения и через 4-6 мес после этого лече0 ния - первый отдаленный срок. На основании последних результатов пациенты были распределены в три группы: А - с четкой положительной динамикой (СП снизилась в 1.7 раза, Пл снизилась в 3 раза)

5 ИМ 103± 3,2%-достоверно в пределах нормы у всех больных группы - 16 детей; В - с нечеткой клинической картиной, т.е. уменьшение размеров опухоли по клиническим показателям (СП в 1,4 раза, ПЛ в 2,3 раза), но с появлением новых точечных очагов и кровоизлияний. ИМ в группе 0 88,0 ± 3,1%. т.е. достоверно ниже нормы; С - с отрицательной динамикой или без изменений в положительную сторону. ИМ 84,0 ± 2,1%, т.е. достоверно ниже нормы. Ретроспективно были определены

5 эти средние показатели: средние значения их в группах А.В.С в сроки II и III. Достоверные различия по ИМ. СП и Пл как между группами, так и внутри групп в сроки II и 111 не выявляются, хотя значения ИМ в группах

0 В и С достоверно ниже нормы до иммунотерапии.

Через 10-12 мес - второй отдаленный срок - проведено повторное обследование больных для подтверждения проведенной

5 оценки эффективности лечения и прогнозирования течения заболевания. В группе А констатирован положительный эффект от проведенного лечения (рубцевание опухоли, ремиссия), подтвержден благоприятный

0 прогноз. ИМ 102 ± 3.0% (без изменений). В группе В положительный эффект достигнут только у одного больного из пяти (рубцевание, благоприятный прогноз) ИМ 98% а у пяти больных - клиническое ухудшение,

5 ИМ 82 ± 4,2%. отрицательная динамика соответствует выводу о неэффективности проведенного лечения и плохому прогнозу в срок 4-6 мес после лечения. В группе С - ухудшение по клинике. ИМ 83 ± 1.0%, подтвержден небла-опри---гнь й прогноз и вывод о неэффективности лечения.

Группа Д (20 больных) - дети с ретиноб- ластомой, у которых достигнута клиническая ремиссия после стандартной терапии (химиолучевой). ИМ 102.0 ± 7 5 % у 65% больных ИМ в норме, т.е. еыше 95%. что указывает на эффективность лечения и благоприятный прогноз, а у 35% больных ИМ ниже 95%, что позволяет рассматривать эту группу как группу риска.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет оценивать

эффективность лечения, в частности имму- нотропного, и прогнозировать развитие заболевания: определять достижение кли- нико-иммукологичеекой ремиссии и возможность рецидиве заболевания. Способ отличается высокой специфичностью, чувствительностью, простотой, воспроизводимостью. Иммунологический показатель - ИМ, оцениваемый предлагаемым способом, четко корректирует с клиническими показателями активности опухолевого процесса ретиноблэстомы до лечения и в отдаленные сроки - через 10-12 мес, а также через 4-6 мес в группах с четкой положительной или отрицательной динамикой. Через 4-6 мес после курса иммунотерапии способ позволяет более точно прогнозировать отдаленные результаты и оценивать эффективность лечения у больных с положительной динамикой по клинике, но с нестабильным течением процесса, когда при явном уменьшении площади и степени проминенции опухоли, ИМ достоверно ниже нормы. В отдаленные сроки

0

5

0

5

через 10-12 мес обнаруживается ухудшение состояния: рецидив опухоли, отрицательная динамика, что трудно предположить по клиническим показателям за 4-6 мес до этих результатов.

Формула изобретени я Способ оценки лечения ретинобласто- мы у детей, включающий исследование лейкоцитов периферической крови, отличающийся тем, что. с целью упрощения, ускорения способа и повышения точности, определяют миграционную активность лей- кЪцитов до начала лечения и далее через 4-6 мес путем определения индексе миграции лейкоцитов с использованием водорастворимых полипептидов из опухолевой ткани ретинобластомы с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг/мл по белку к дозе лейкоцитов 2.5x105, учитывают результат через 17 ч от начала реакции и при значениях индекса миграции выше 95% оценивают лечение как эффективное, ниже 95% - недостаточное лечение.

Изобретение относится к онкоофталь- мологии и может быть использовано для оценки эффективности лечения, прогнозирования развития ретинобластомы и достижения клинико-иммунологической ремиссии. Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение точности способа. Способ включает иммунологиче- ское исследование периферической крови больного с использованием клеток ретинобластомы. Новым в способе является то. что противоопухолевый иммунитет оценивают по функциональной активности Т-лимфо- цитов в реакции миграции лейкоцитов в агаре с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ретинобластомы, содержащих специфически активные полипептиды с мол.м. 50-100 кД. Способ позволяет оценивать эффективность лечения ретинобластомы, в частности иммунотропного. прогнозировать течение заболевания. В отличие от прототипа способ является более простым и точным, отличается высокой специфичностью. (Л С