СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ФОСФОИНОЗИТИДНОГО ОБМЕНА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/92 A61K38/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена при лечении связанных с ним заболеваний и может быть использовано в экспериментальной медицине.

В последние годы интенсивно изучается роль основных компонентов биологических мембран - фосфоинозитидов - как в процессах нормального функционирования живой клетки, так и при возникновении и развитии заболеваний, сопровождающихся нарушением содержания фосфоинозитидов (Швец В.И., Степанов А. Е. , Крылова В.Н. и др. Мио-инозит и фосфоинозитиды.-М.:Наука, 1987.- 248 с.; Слюсарь Н.Н. Роль фосфоинозитидов и их метаболитов в онкогенезе: Дис. .. . докт. мед. наук. - СПб., 1993.- 286 с.; Berridge M.J. Oncogenes, inositol lipids and cellular proliferation //Biotechnol.- 1984.- V.2, N.6 - Р.541-546). Важная роль фосфоинозитидов в жизнедеятельности клеток связана с их непосредственным участием в регуляторной, транспортной, энергетической и пластической функциях биологических мембран (Швец В. И., Степанов А.Е., Крылова В.Н. и др. Мио-инозит и фосфоинозитиды.-М.:Наука, 1987.- 248 с.; Michell R.Н. Inositol phospholipids in membrane function.//Trands.Biochem.Sor. -1979. -V.4,N.6.-Р.128-131). Было доказано, что содержание фосфоинозитидов в крови отражает специфику изменений обменных процессов, происходящих в организме, поскольку установлено участие инозитсодержащих липидов в переходе клеток к неконтролируемому росту и трансформации (Berridge M.J. Inositol tryphosphate and diacylglycerole: two interacting second messengers //Annu Rev. Biochem.- 1987.- V.56.- Р.159-193; Слюсарь Н.Н. Роль фосфоинозитидов и их метаболитов в онкогенезе: Дис. ... докт.мед.наук.- СПб., 1993.- 286 с.). Было установлено, что при возникновении заболеваний, сопровождающихся развитием контролируемой и неконтролируемой пролиферацией наблюдаются количественные изменения содержания различных фосфоинозитидов и образующихся при их гидролизе вторичных мессенджеров (Дамиров М.М., Слюсарь Н.Н., Кулаков В.И. и др. Изменение фосфоинозитидного обмена в крови и ткани доброкачественных и злокачественных опухолей матки. //Акуш. и гинек.-1995. -N2.-С.39-41). Одновременно было отмечено, что происходит значительное снижение содержания одного из основных активаторов иммунокомпетентных клеток - фосфоинозитидов- у больных с доброкачественными и злокачественными заболеваниями различных локализаций по сравнению со здоровыми людьми (Слюсарь Н.Н. Изменение содержания прочносвязанных фосфоинозитидов в клетках крови и опухолевой ткани у мышей линии C57BL с карциномой Льюис и больных раком легкого//Эксперим.онкология. -1993.-Т.15.-N2.- С.51-59; Дамиров М.М., Кулаков В.И., Слюсарь Н.Н. Изменение содержания фосфоинолзитидов в форменных элементах крови и ткани эндометрия у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия.// Акуш. и гинек.-1995.-N 4.-С.43-46).

Известен способ коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена путем внутрисосудистого облучения крови с помощью гелий-неонового лазерного облучения (Дамиров М.М., Бакулева Л.П., Слюсарь Н.Н. и др. Лазерная терапия в реабилитационном послеоперационном лечении у больных внутренним эндометриозом.// Акуш. и гинек.-1996.- N.2.- С.39-43). Однако известный способ не дает возможности эффективного восстанавливать возникающие нарушения обмена фосфоинозитидов и их метаболитов, а также оказывать воздействие в течение крайне непродолжительного времени (до 3-х месяцев).

В качестве ближайшего аналога принят способ коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена (Слюсарь Н.Н. Изменение содержания фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в иммунокомпетентных клетках у мышей с карциномой легкого Льюис и больных раком легкого при лазерном облучении крови и введении препаратов фосфатидилинозитов.// Эксперим.онкология.- 1992.- Т.14, N.4.- С. 60-66). Способ включает проведение исследования крови больного с последующим определением содержания фосфоинозитидов, при выявленном нарушении которого в организм больного вводят лекарственный препарат липостабил, содержащий в своем составе эссенциальные фосфолипиды, в сочетании с внутривенным лазерным облучением крови с помощью гелий-неонового лазера.

Однако известный способ позволяет воздействовать лишь на отдельные фрагменты метаболизма фосфоинозитидов, не учитывая при этом многообразие различных фосфорилированных форм фосфоинозитидов и образующихся при их гидролизе вторичных мессенджеров, которые также влияют на функциональную активность клеток организма. Кроме того, недостатком указанного способа является непродолжительность его воздействия (до трех месяцев) для полного восстановления содержания фосфоинозитидов на длительный срок и невозможность определить их влияние на конкретные типы фосфоинозитидов при восстановлении метаболизма фосфоинозитидов.

Задачей изобретения является создание способа коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена, позволяющего получить более выраженный и стойкий терапевтический эффект.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе коррекции фосфоинозитидного обмена, включающем исследование крови больного с определением содержания фосфоинозитидов и последующее введение в его организм липидкоррегирующего активного вещества, в крови дополнительно определяют содержание инозитсодержащих вторичных мессенджеров и фосфорилированных форм фосфоинозитидов и при выявленном отклонении полученных величин от нормативных показателей в организм больного вводят внутривенно однократно суспензию липосом из расчета 20-40 мл/кг массы, содержание фосфоинозитидов в которой расcчитывают по формуле: С= 2,5 • (2 а + 4b + b1 + 3c + c1), где: C - количество фосфоинозитидов в нг, а - разница содержания фосфоинозитидов в норме и патологии, b - соотношение фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов в норме и патологии, b1 - соотношение фосфатидилинозит-3,4-дифосфатов, фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатов в норме и патологии, c - соотношение инозит-1,4,5-трифосфатов в норме и патологии, c1 - соотношение инозит-1,3,4-трифосфатов, инозит-1,3,4,5-тетрафосфатов в норме и патологии.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Способ позволяет значительно повысить терапевтический эффект при лечении заболеваний, сопровождающихся нарушением фосфоинозитидного обмена, снизить частоту неудовлетворительных результатов лечения.

Полученный терапевтический эффект является более стойким, так как использование способа дает возможность на длительный срок (до 6 месяцев) восстанавливать содержание фосфоинозитидов в крови.

Высокая эффективность способа обусловлена тем, что авторы впервые предлагают вводить в организм больного липосомы, содержащие фосфоинозитиды в количественном соотношении, рассчитанном математически точно и индивидуально для каждого больного в зависимости от установленных нарушений фосфоинозитидного обмена.

Способ дает возможность индивидуально и комплексно корригировать выявленные нарушения фосфоинозитидного обмена, включающие в себя восстановление содержания всех фосфорилированных форм фосфоинозитидов и образующихся при их гидролизе вторичных мессенджеров.

Способ является патогенетически обоснованным для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением фосфоинозитидного обмена, поскольку происходит воздействие на основные причины, приводящие к возникновению и прогрессированию установленных заболеваний.

Способ осуществляется следующим образом. Предварительно проводят исследование крови больного. С помощью хроматографических методов анализа определяют количественное содержание фосфоинозитидов - фосфатидилинозитов (ФИ), фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ'), фосфатидилинозит-4-фосфатов (ФИФ), фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов (ФИДФ), фосфатидилинозит-3,4-дифосфатов (ФИДФ'), фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатов (ФИТФ), образующихся при их гидролизе вторичных мессенджеров - инозитол-1,4,5-трифосфатов (ИР3), инозитол-1,3,4-трифосфатов (ИР3'), инозитол-1,3,4,5-тетрафосфатов (ИР4), диацилглицеролов (ДГ). При выявленном отклонении полученных величин от нормативных показателей в организм больного вводят внутривенно однократно суспензию липосом из расчета 20-40 мл/кг массы. Содержание фосфоинозитидов, необходимое для внутривенного введения в составе липосом и восстановления их уровня в крови, определяют по формуле: C= 2,5 • ( 2а + 4b + b1 + 3c + c1), где: C - количество фосфоинозитидов в нг, а - разница содержания фосфоинозитидов в норме и патологии, b - соотношение фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов в норме и патологии, b1 - соотношение фосфатидилинозит-3,4-дифосфатов, фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатов в норме и патологии, c - соотношение инозит-1,4,5-трифосфатов в норме и патологии, c1- соотношение инозит-1,3,4-трифосфатов, инозит-1,3,4,5-тетрафосфатов в норме и патологии.

Для приготовления липосом используют хроматографически чистые фосфолипиды, выделенные из головного мозга быка: фосфатидилхолин (ФХ), фосфоинозитиды (ФИН), образованные из фосфатидилинозитов (ФИ), фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов (ФИДФ), фосфатидилинозит-3,4- дифосфатов (ФИДФ'), фоcфатидилинозит-3,4,5-трифосфатов (ФИТФ), и инозитолтри-четырефосфаты, образованные из инозитол-1,4,5-трифосфатов (ИР3), инозитол-1,3,4-трифосфата (ИР3'), инозитол-1,3,4,5-четырефосфатов (ИР4) в молярном отношении 4: 1: 0,02. Смесь хлороформных растворов указанных ФХ, ФИН и инозитолтри-четырефосфатов упаривают в вакууме досуха, а затем суспендируют в среде, содержащей 150 мМ NaCl. Дисперсию фосфолипидов обрабатывают ультразвуком при охлаждении на дезинтеграторе Sonic-300 ("Fisher", США) в течение 10 минут (мощность 225 Вт). Для осаждения липосом суспензию центрифугируют при 20000 д в течение 40 минут. Для стерилизации полученных липосом перед использованием in vivo их продавливали через ядерный фильтр Nuclepor (США) с диаметром пор 0,2 мкм.

В опытах использовали 1070 мышей обоего пола линии C57BL массой 25 г: из них 820 - с карциномой легкого Льюис (карциному легкого Льюис (33LL) прививали в заднюю лапку введением 0,02 мл взвеси клеток (3 • 10⁵) и 250 интактных мышей. Введение препарата в хвостовую вену мышей осуществлялось однократно на 8-10 сутки после прививки из расчета 50-100 мкл препарата на 25 г веса животного, что соответствует 20-40 мл/кг массы. В препарате распределение инозитсодержащих липидов было следующим: из фосфоинозитидов в процентном и абсолютном значениях ФИ составляли 94,4% (164,3 нг), ФИДФ - 3,4% (5,3 нг), ФИДФ - 1% (1,75 нг), ФИТФ - 1,56% (2,76 нг); из инозитолтри-четырефосфатов: ИР3 - 68,2% (0,015 нг), ИР3' - 18,2% (0,004 нг), ИР4 - 13,6% (0,003 нг).

Проведенные исследования in vitro на клетках крови, выделенных из крови мышей с карциномой легкого Льюис, с помощью радиоактивных меток 14 C-фосфатидилхолин, меченных 32 P, myo -[2-3Н]-инозитола, [ γ- 32P] АТФ [3 H] различных фосфоинозитидов, а также флюоресцентных зондов показало включение фосфоинозитидов во всех клетках крови.

В качестве примера нами проведен сравнительный анализ влияния внутрисосудистого лазерного облучения крови (ВЛОК) в сочетании с липостабилом (известный способ, I группа) и разработанного способа коррекции нарушенного содержания фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма путем использования липосом с включенными в их состав в расчетных единицах ФИ, ФИДФ, ФИДФ', ФИТФ, ИР3, ИР3', ИР4 (группа II) на цельную кровь и опухоль у 950 мышей без и с карциномой легкого Льюис (3LL). В изучаемых группах липосомы с включенными в их состав фосфоинозитидами вводили в хвостовую вену однократно на 8-10 сутки после перевивки опухоли; ВЛОК и липостабил по известной методике (Слюсарь Н.Н. Изменение содержания фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в иммунокомпетентных клетках у мышей с карциномой легкого Льюис и больных раком легкого при лазерном облучении крови и введении препаратов фосфатидилинозитов. // Эксперим.онкология.- 1992.- Т.14, N.4.- С.60-66), использовали в эти же сроки.

Анализ полученных данных позволил установить, что использование предложенного нами способа коррекции нарушенного содержания фосфоинозитидов дало возможность восстановить их количество в цельной крови у мышей II группы до уровня, как у интактных мышей, в то время как при использовании известного способа (ВЛОК + липостабил) полной нормализации содержания фосфоинозитидов не происходило (табл.1). Следует отметить, что использование предложенного нами способа позволило восстановить уровень фосфоинозитидов в клетках крови, чего не достигалось при использовании известного способа. Восстановление уровня фосфоинозитидов, ИР3, ИР3' и ИР4 в крови и клетках крови у мышей II группы сопровождалось отчетливым восстановлением их содержания в ткани, пораженной опухолью (табл.2); при использовании известного способа, хотя и имелась отчетливая тенденция к восстановлению показателей фосфоинозитидов в опухоли, тем не менее, полной нормализации не происходило. Положительный эффект от использования предложенного нами способа можно объяснить тем, что в липосомы включались основные фосфоинозитиды - ФИ, количество которых при образовании опухоли в крови снижается, а также другие фосфоинозитиды - ФИДФ, ФИДФ', ФИТФ и продукты их гидролиза ИР3, ИР3', ИР4, изменяя при это метаболизм фосфоинозитидов.

Введение расчетных единиц фосфоинозитидов исходя из их значений до лечения позволило полностью нормализовать их уровень в крови, что в дальнейшем отразилось на содержании фосфоинозитидов в ткани, пораженной опухолью. Следствием перечисленного явилось значительное возрастание продолжительности жизни животных, а также снижение количества и объема метастазов по разработанному нами способу в сравнении с таковыми у мышей I группы (табл.3). Авторами изобретения проведен анализ изменения содержания фосфоинозитидов при инкубации in vitro клеток крови с липосомами, в которые были включены в расчетных единицах меченные фосфоинозитиды у 100 больных с раком легкого, матки, молочной железы, желудка и прямой кишки. Получены следующие данные: 1) уровень ФИ был восстановлен во всех клетках крови, а в лимфоцитах превышал в среднем в 1,4 раза их содержание у здоровых людей; 2) выравнивание количества фосфорилированных в D-3 и D-4 позициях инозитольного кольца ФИ фосфорилированных форм фосфоинозитидов; 3) уровень вторичного мессенджера ИР3 в среднем в 1,1 раза превышал количество ИР3' и ИР4 в исследуемых клетках крови. Проведенные in vitro исследования на клетках крови позволили установить, что введение липосом с включенными в их состав фосфоинозитидами нормализуют метаболизм фосфоинозитидов в клетках крови.

Приготовленная по предлагаемому способу суспензия липосом с включенными в его состав инозитсодержащими липидами обладает низкой токсичностью. В экспериментах на мышах не было установлено эмбриотоксического и тератогенного действия препарата на протяжении всего срока беременности. Приведенный экспериментальный материал подтверждает возможность использования способа коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена в клинической практике.

В табл. 1 и 2 результаты выражены для ФИ, ФИФ, ФИФ', ФИДФ, ФИДФ', ФИТФ в нмоль фосфора соответствующего фосфоинозитида на 1 мг белка; для ИР3, ИР3', ИР4 - в пмоль соответствующего липида на 1 мг белка.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в экспериментальной медицине. Исследуют кровь больного, определяют содержание фосфоинозитидов, инозитсодержащих вторичных мессенджеров и фосфорилированных форм фосфоинозитидов и при выявленном отклонении полученных величин от нормативных показателей в организм больного вводят суспензию липосом из расчета 20-40 мл/кг массы, содержание фосфоинозитидов в которой рассчитывают по формуле: С = 2,5•(2а + 4b + b1 + 3с + с1); где С - количество фосфоинозитидов в нг; a - разница содержания фосфоинозитидов в норме и патологии; b - соотношение фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов в норме и патологии; b1 - соотношение фосфатидилинозит-3,4-дифосфатов, фосфатидилинозит-3,4, 5-трифосфатов в норме и патологии; c -соотношение инозит-1,4,5-трифосфатов в норме и патологии; c1 - соотношение инозит-1,3,4-трифосфатов, инозит-1,3,4,5-тетрафосфатов в норме и патологии. Способ обеспечивает получение выраженного и стойкого терапевтического эффекта. Он дает возможность индивидуально и комплексно корригировать выявленные нарушения фосфоинозитидного обмена. 3 табл.

Способ коррекции нарушений фосфоинозитидного обмена, включающий исследование крови больного с определением содержания фосфоинозитидов и последующее введение в его организм липидкорригирующего активного вещества, отличающийся тем, что в крови дополнительно определяют содержание инозитсодержащих вторичных мессенджеров и фосфорилированных форм фосфоинозитидов и при выявленном отклонении полученных величин от нормативных показателей в организм больного вводят внутривенно однократно суспензию липосом из расчета 20 - 40 мл/кг массы, содержание фосфоинозитидов в которой рассчитывают по формуле
C = 2,5 (2a + 4b + b1 + 3с + с1),
где C - количество фосфоинозитидов в нг;
a - разница содержания фосфоинозитидов в норме и патологии;
b - соотношение фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов в норме и патологии;
b1 - соотношение фосфатидилинозит -3,4-дифосфатов, фосфатидил-инозит-3,4,5-трифосфатов в норме и патологии;
с - соотношение инозит-1,4,5-трифосфатов в норме и патологии;
с1 - соотношение инозит-1,3,4-трифосфатов, инозит-1,3,4,5-тетрафосфатов в норме и патологии.