СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и предназначено для определения функциональной активности лимфоцитов.

Цель изобретения - повышение точности способа определения функциональной активности лимфоцитов.

Наиболее близким к заявляемому способу являются определение активности лимфоцитов по их способности к розеткообразованию с эритроцитами барана (E-POK), а также по активности лимфоцитарных ферментов, в частности лактатдегидрогеназы.

В качестве аналога заявляемого способа известен способ определения иммунологического статуса организма по способности лимфоцитов к розеткообразованию с эритроцитами барана после их инкубации с левамизолом. При этом лимфоциты, выделенные из периферической крови пациента, разделяют на 2 пробы и инкубируют с левамизолом в концентрации 1 пг/мл и 10 мкг/мл. Затем проводят реакцию E-розеткообразования, подсчитывают показатели в каждой пробе, вычисляют разность показателей между первой и второй пробами, и при положительном значении разности определяют нарушение иммунологического статуса, а при отрицательном значении - отсутствие нарушения статуса. Однако этот метод имеет ряд недостатков, так как является достаточно трудоемким и не позволяет точно оценить функциональное состояние лимфоцитов.

В качестве прототипа предлагаемого способа известен способ определения активации B-лимфоцитов по энзимному спектру лактатдегидрогеназы. С этой целью для оценки состояния B-лимфоцитов определяют изоэнзимный спектр лактатдегидрогеназы в B-лимфоцитах периферической крови и по коэффициенту ЛДГ1/ЛДГ5 судят о состоянии B-лимфоцитов. Значение коэффициента выше 1,45 свидетельствует об активации B-системы иммунитета. Недостатком известного способа является недостаточная точность определения состояния B-лимфоцитов вследствии низкой специфичности указанных ферментов.

Преимуществом предложенного нами способа оценки функциональной активности лимфоцитов по сравнению с существующими является большая точность метода, которая достигается определением уровня содержания фосфатидилинозитов, имеющим непосредственное отношение к процессам активации иммунокомпетентных клеток, в частности лимфоцитов. Достоинством метода является простота исполнения, возможность воспроизведения в любой биохимической лаборатории, сравнительная быстрота выполнения (10-15 анализов за 3 ч), отсутствие необходимости использования дорогостоящего оборудования.

Способ осуществляется следующим образом. Лимфоциты периферической крови выделяют на градиенте плотности фиколл-верографина. Полученные клеточные взвеси трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида. 0,02 мл взвесей отбирают для определения белка биуретовым методом. Затем к клеточным взвесям добавляют 50 мкм хлорида кальция, при этом ионы Ca²⁺ вызывают переход клеток в новое функциональное состояние. После этого в течении 3 мин через каждые 30 с из инкубационной смеси отбирают пробы объемом 5 мкл с таким расчетом, чтобы в них содержалось 0,1 мл белка и наносят на старт хроматографической пластинки (хроматографические пластины получают путем седиментации на стеклянные пластины тонкого слоя адсорбента на водной суспензии, содержащей 5 г/л силикагеля и 0,5% K₂CO₃. При этом происходит лиофилизации проб и прекращение биохимических процессов, влияющих на изменения содержания фосфатидилинозитов (ФИ), т.е. в каждой пробе фиксируется определенный уровень ФИ. Для ускорения стабилизации перед нанесением очередной пробы вносят тонкий слой 1-2 мкл денатурирующего агента - 5% трихлоруксусной кислоты.

Для повышения точности анализа все пробы, отбираемые в динамике из исследуемой инкубационной среды, наносят на одну хроматографическую пластину, тонкий слой сорбента на которой разделен на 10-15 дорожек шириной 5 мм каждая, чем достигается стандартизация условий хроматографии и денситометрии. Разделение фосфолипидов осуществляют методом проточной горизонтальной хроматографии в системе хлороформ-метанол-7Н аммиак (13:7:1). Идентификацию инозитсодержащих липидов проводят с помощью значений Rf, цветных тестов и свидетеля фосфатидилинозитола фирмы "Sigma". Количественное содержание фракции фосфатидилинозитов, имеющей Rf=0,47, определяют по фосфору, после проявления хроматограмм серной кислотой, и рассчитывают в нмолях фосфора на 1 мг белка или денситометрически по калибровочной кривой зависимости площади пика от стандартного фосфоинозитида. Экстракция фосфоинозитидов непосредственно в процессе хроматографии обеспечивает максимальную сохранность этих высоколабильных соединений, что позволяет эффективно анализировать быстрые изменения этих веществ.

Данные динамики изменений уровня содержания фосфатидилинозитов изложены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают, что исходный уровень фосфатидилинозитов в лимфоцитах крови у больных бронхиальной астмой в 1,4 раза, а у больных раком легкого в 1,7 раза ниже, по сравнению со здоровыми донорами. Через 60 с после инкубации с кальцием наблюдается максимальное повышение уровня содержания ФИ в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой в 1,15 раза, а у больных раком легкого в 1,4 раза, по сравнению с исходным уровнем, тогда как у доноров в этот период наблюдается максимальное снижение содержания ФИ в 1,5 раза. Одновременно отмечается уменьшение амплитуды колебаний ФИ у больных бронхиальной астмой до 13,1±1,0 нмоль фосфора/мг белка, у больных раком легкого до 13,8±0,7 нмоль фосфора/мг белка, тогда как у здоровых доноров этот показатель составляет 21,1±1,1 нмоль фосфора/мг белка.

Пример 1. Больная Д., 51 г, находилась на лечение в Тверском областном онкологическом диспансере с диагнозом - рак левой молочной железы, подтвержденным гистологически. У больной исходный уровень ФИ в лимфоцитах крови составил 22,1 нмоль фосфора/мг белка, к 60-ой с после инкубации лимфоцитов с кальцием повысился до 34,3 нмоль фосфора/мг белка, минимальное содержание ФИ наблюдалось на 90-ой с исследования и составило 19,9 нмоль фосфора/мг белка, амплитуда колебаний ФИ была 14,4 нмоль фосфора/мг белка. Следовательно, согласно предлагаемому способу, у больной выявлено снижение функциональной активности лимфоцитов.

Пример 2. Больной К., 44 г, находился в терапевтическом отделении 6-й городской больницы г. Твери с диагнозом бронхиальная астма, атопическая, среднетяжелая. У больного исходный уровень ФИ в лимфоцитах составил 31,2 нмоль фосфора/мг белка, максимальное содержание ФИ в лимфоцитах составило 36,1 нмоль фосфора/мг белка на 60-ой с, минимальное 22,4 нмоль фосфора/мг белка, амплитуда колебаний 13,7 нмоль фосфора/мг белка. На основании полученных данных делается вывод о снижении функциональной активности лимфоцитов.

Пример 3. Больной В., 49 лет, находился на лечении в гематологическом отделении Тверской областной клинической больницы с диагнозом лимфогранулематов 11А стадия, ремиссия 12 лет. Исходный уровень ФИ составил 41,8 нмоль фосфора/мг белка, максимальное содержание ФИ 48,7 нмоль фосфора/мг белка, минимальное 28,9 нмоль фосфора/мг белка, амплитуда колебаний ФИ составила 19,8 нмоль фосфора/мг белка. Заключение: функциональная активность лимфоцитов в норме.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано для определения функциональной активности лимфоцитов. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ предназначен для оценки функциональной активности лимфоцитов. Для этого с помощью метода проточной горизонтальной хроматографии определяют одни из основных активаторов иммунокомпетентных клеток - фосфатидилинозиты после инкубации лимфоцитов с Са^2 + через 60 и 90 с. При снижении амплитуды колебаний фосфатидилинозитов в 1,3 раза и более в сравнении со здоровыми донорами определяют снижение функциональной активности лимфоцитов. Способ имеет большую точностью по сравнению с известными, так как исследуется амплитуда колебаний веществ, имеющих непосредственное отношение к процессам активации иммунокомпетентных клеток, в частности лимфоцитов. 1 табл.

Способ определения функционального состояния лимфоцитов путем исследования содержания фосфатидилинозитов в лимфоцитах, отличающийся тем, что с целью повышения точности метода определяется содержание фосфатидилинозитов в лимфоцитах крови через 60 и 90 с после инкубации с кальцием и при снижении амплитуды колебаний фосфатидилинозитов в 1,3 раза и более по сравнению со здоровыми донорами определяют снижение функциональной активности лимфоцитов.