СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ И РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, онкологии, и предназначено для дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы.

Проблема ранней диагностики рака предстательной железы остается одной из наиболее актуальных в современной медицине, поскольку наблюдается его неуклонный рост у мужчин старше 45 лет. В дифференциальной диагностике опухолевых заболеваний предстательной железы используются клиническая и ультразвуковая диагностика, выполнение биопсии под ультразвуковым контролем, радиологическая диагностика (Валуцкас К.К., Лазутка В.П., Аткочюс В.Б. и В. Л. Шпикалов В.Л. Способ дифференциальной диагностики заболеваний предстательной железы. Авторское свидетельство N 1655467 (1991 г.)). Однако указанные методы не обладают высокой точностью, которая колеблется в пределах от 50 до 89%.

Определенное значение в диагностике опухолевых заболеваний имеет биохимическое исследование крови, в частности определение кислой фосфатазы у больных раком предстательной железы (Пашенцева Л.П., Соколов А.В., Ледян К.М., Макарова Г.В.,. Бухаркин Б.В. Определение простатической фосфатазы у больных раком предстательной железы //Тезисы общесоюзной конференции "Актуальные вопросы биохимической и иммунологической диагностики злокачественных новообразований" - М., 1989.- с. 169-171).

Однако чувствительности и специфичности методов определения кислой фосфатазы недостаточно для проведения точной дифференциальной диагностики доброкачественной и злокачественной патологии предстательной железы.

В качестве прототипа принят биохимический способ диагностики опухолей предстательной железы с помощью простата - специфического антигена (ПСА) (Castaldo G., Cecere G., di Fusco V., Prezioso D., Armiento М., Salvatore F. Prostate - specific antigen (protein and RNA) analysis in differential diagnosis and staging of prostate cancer //Clin/ Chim. Acta. - 1997 - 265 (1) -P. 65-76). Однако использование ПСА в ранней диагностике и скрининге рака может ограничиваться из-за его низкой специфичности, обусловленной повышением концентрации ПСА в сыворотке крови больных с не злокачественными заболеваниями предстательной железы, а также у здоровых мужчин пожилого возраста. Следовательно указанный способ не может с высокой точностью проводить дифференциальную диагностику опухолевых заболеваний предстательной железы.

Таким образом, существующие способы не дают возможности достоверно диагностировать опухолевую патологию предстательной железы, что осложняет разработку адекватной терапии у этих больных.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Cущность изобретения состоит в том, что в способе дифференциальной диагностики доброкачественной и злокачественной патологии предстательной железы путем исследования цельной крови, отличительной особенностью является то, что методом прочной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ 1) и при их значениях от 0,15 до 0,19 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка судят о норме, при значении от 0,1 до 0,08 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы, а от 0,04 до 0,01 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка рак предстательной железы.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ обладает высокой точностью и позволяет исследовать ФИФ 1 при малейших изменениях их концентрации. Точность способа составляет 95,5%, чувствительность 0,1 мг, ошибка метода 1+0,2%.

Способ является неинвазивным, позволяет своевременно диагностировать переход доброкачественного процесса в злокачественный и дает возможность разрабатывать оптимальную тактику ведения данного контингента больных. Достоинством метода является простота исполнения и возможность воспроизведения в любой биохимической лаборатории.

Выбор ФИФ 1 в качестве диагностического теста был обусловлен тем, что фосфоинозитиды являются одним из основных компонентов биологических мембран, выполняют функцию вторичных мессенджеров в передаче трансмембранных сигналов и служат маркером пролиферативного роста. Кроме того известно, что активация фосфатидилинозит-3-киназы, с помощью которой образуется 3-фосфорилированные формы фосфоинозитидов, критична для стимуляции клеточного роста и трансформации.

Способ осуществляется следующим образом.

Из 3 мл цельной крови экстрагируют липиды смесью хлороформ-метанол (1: 1), фильтруют, осадок на фильтре 3-кратно промывают смесью хлороформ-метанол (2: 1), содержащий 1% HCl (по объему). К фильтру добавляют 0,4 мл 0,02% CaCl₂, затем в течение 4 - 5 мин перемешивают. После четкого расслоения верхнюю фазу отсасывают и экстракт отмывают от нелипидных примесей смесью хлороформ-метанол - 0,02% CaCl₂ (3:48:47). Отмытую хлороформную фазу упаривают в токе азота, предварительно внеся в нее 2 - 5 мкл антиоксиданта - ионола, затем растворяют в 50 мкл хлороформ-метанол (2:1). Исследуемый образец наносят на хроматографическую пластинку в виде сплошной узкой полосы. Силикагель марки L 5\40 ("Chemapol", ЧСФР) наносят на пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий, содержащих 5% К₂CO₃. Выделение фосфолипидов проводят методом проточной горизонтальной хроматографии в системе хлороформ-метанол - 7 H аммиак (13:7:1). При этом фронт растворителя достигает края пластинки через 60 мин, после чего хроматографию продолжают в условиях протока (15 мин). Идентификацию фосфолипидов осуществляют с помощью свидетелей фосфолипидов ("Sigma", США) и цветных тестов. Установлено, что фосфолипидные фракции на хроматограммах располагаются в порядке возрастания Rf следующим образом: сфингомиелины (Rf = 0,19), фосфатидилхолины (Rf = 0,36), фосфоинозитиды (Rf = 0,47), фосфатидилсерины (Rf = 0,58), фосфатидилэтаноламины (Rf = 0,63). Затем участок сорбента с фракцией фосфоинозитидов обводят препаровальной иглой и собирают в пробирку с 10 мл смеси метанол-соляная кислота (1:1). Собранный силикагель встряхивают 10 - 12 мин с указанной смесью растворителей и отстаивают в течение 60 мин. Затем фильтруют, а гель на фильтре промывают в 5 мл смеси метанол-соляная кислота. Объединенный элюат упаривают в токе азота, предварительно внеся в него 5 мкл ионола и наносят на хроматографическую пластинку в виде точек. Силикагель марки L 5\40 ("Chemapol", ЧСФР) наносят на пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий, содержащий 15% К₂СО₃. Фракционирование фосфоинозитидов проводят в системе хлороформ-метанол - 7 H аммиак (11:4,5:1) в течение 90 мин, из них 20 мин составляет проток. Идентификацию ФИФ 1, имеющую Rf = 0,34, проводят с помощью свидетелей фирмы "Sigma" (США) после проявления хроматограммы серной кислотой и расчитывают в нмолях фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка. Концентрацию белка определяют биуретовым способом.

При этом уровень содержания ФИФ 1 у здоровых мужчин составляет от 1,5 до 0,19 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка, у больных с доброкачественной гиперплазией предстательной железы от 0,1 до 0,08 нмоль фосфора на 1 мг белка, а у больных с раком предстательной железы - от 0,04 до 0,01 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка.

Нами дополнительно были проведены исследования содержания ФИФ 1 в цельной крови у 25 больных с хроническим простатитом. Количество ФИФ 1 в крови составило 0,24-0,28 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка, что гораздо выше их уровня в крови у здоровых людей и больных с опухолевыми заболеваниями предстательной железы.

Изучение содержания ФИФ 1 в цельной крови у 110 больных с доброкачественной и злокачественной патологией предстательной железы позволило правильно поставить диагноз у 105 человек, что составило 95,5% и лишь у 5 (4,5%) из 110 больных не удалось правильно провести дифференциальную диагностику опухолевых заболеваний предстательной железы. Точность способа составила 95,5%.

Пример 1. Больной К, 56 лет, находится на лечении в урологическом отделении Тверского областного онкологического диспансера с 1.04.99 г. по 6.05.99 г. с диагнозом рак предстательной железы. У больного исходный уровень ФИФ 1 в цельной крови составил 0,03 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка, на основании полученных данных высказано предположение о раке предстательной железы. При гистологическом исследовании установлен заключительный диагноз: рак предстательной железы.

Пример 2. Больной П, 58 лет, находится на обследовании в урологическом отделении Тверского областного онкологического диспансера с подозрением на рак предстательной железы с 3.09.99 по 27.09.99 г. у больного исходный уровень ФИФ 1 в цельной крови составил 0,09 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка - было высказано предположение о доброкачественной природе новообразования предстательной железы.

При гистологическом исследовании установлен заключительный диагноз: аденома простаты.

Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики и проводить дифференциальную диагностику опухолевых образований предстательной железы.

Способ может быть использован в медицине, а именно в урологии и онкологии, для дифференциальной диагностики опухолевых заболеваний предстательной железы. В цельной крови методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ 1). И при значениях 0,1 - 0,08 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы, а при значении 0,04 - 0,01 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка -рак предстательной железы. Способ повышает точность дифференциальной диагностики опухолевых образований предстательной железы.

Способ дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что из цельной крови выделяют липидную фракцию, в которой методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозит-3-фосфатов и при значениях 0,1 - 0,08 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы, а при значении 0,04 - 0,01 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка - рак предстательной железы.