СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТИПИЧЕСКОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 G01N33/573 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии.

Диагностика гиперпластических процессов эндометрия не представляет особых трудностей, однако имеет несколько спорных моментов. Распознавание патологических процессов эндометрия до появления клинической симптоматики возможно при эхографическом трансвагинальном сканировании в сочетании с цветовым доплеровским картированием. Имеется четкая взаимосвязь между толщиной эндометрия, измеряемой с помощью эхографического исследования, и наличием патологии эндометрия. Для доброкачественных процессов эндометрия характерны отсутствие кровотока в эндометрии или «бедный» периферический внутриопухолевый кровоток со средними значениями сосудистого сопротивления. Появление интенсивной васкуляризации новообразования свидетельствует о переходе ткани к опухолевому состоянию. (Панкратов В.В. Цветное доплеровское картирование и эндохирургические технологии в диагностике и лечении гиперпластических процессов в эндометрии у женщин репродуктивного возраста. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. Сургут, 2001).

Применение только эхографии для диагностики атипической гиперплазии эндометрия не является достаточным, так как этот метод не специфичен для данного заболевания.

Цитологическое исследование аспирата из полости матки имеет высокую диагностическую ценность, но не является достаточным для достоверной постановки диагноза.

Из-за возможной множественной локализации патологического процесса в слизистой матки или одновременного существования различных типов гиперплазии эндометрия оптимальным является проведение раздельного диагностического выскабливания матки под контролем гистероскопии с последующей морфологической верификацией диагноза.

Однако и кюретаж матки не всегда позволяет полностью изучить весь эндометрий, так как участки с клеточной атипией могут не попасть к морфологу. Кроме того, отсутствие гистологических признаков атипической гиперплазии или аденокарциномы не исключает наличие злокачественного процесса в матке в том случае, если остаются клинические симптомы заболевания. (Сидорова И.С., Шешукова Н.А., Федотова А.С. Российский вестник акушера-гинеколога, 2008; 5).

Известен способ ранней диагностики доброкачественных гиперпластических процессов эндометрия, для реализации которого используются показатели оксидантного и антиоксидантного статуса, в частности соотношения глутатионпериксидаза/диеновые конъюгаты и глутатионпериксидаза/восстановленный глутатион в венозной крови, являющиеся диагностическим критерием наличия железисто-фиброзных полипов, железистых полипов и железисто-кистозной гиперплазии эндометрия (Патент РФ № 2190221 от 27.09.2002 г.).

Этот способ не является достоверным, так как окончательный диагноз может быть выставлен только на основании гистологического заключения.

Сущность другого изобретения (патент РФ № 2159441 от 20.11.2000 г.) заключается в том, что в способе диагностики гиперпластических процессов эндометрия, включающем количественное определение содержания биологически активных веществ в крови, определяют количество лизосомального фермента b-D-глюкуронидазы и при уровне от 0,01 до 0,02 нмоль/мин/мг диагностируют гиперплазию эндометрия.

Недостатком этого метода является то, что несмотря на сравнительную простоту и доступность в получении биоматериала, сокращение временных затрат, окончательный диагноз в любом случае ставится на основании гистологического исследования.

Задачей изобретения является повышение точности диагностики атипической гиперплазии эндометрия.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что методом непрямой иммунофлюоресценции определяют количество клеток с лизилоксидазой на единицу поля зрения в парафиновых срезах эндометрия после обработки специфическими поликлональными антителами к лизилоксидазе и при увеличении клеток более чем на 67% по отношению к норме, делают вывод о наличии атипической гиперплазии эндометрия.

Практически способ осуществляют следующим образом.

Парафиновый блок изготавливается по стандартной технологии. Кусочек эндометрия размером 5-10 мм, полученный в результате раздельного диагностического выскабливания матки, фиксируют в 20-кратном объеме 10%-водного раствора формалина в течение 24 часов. После промывания водой образец помещают в 70% раствор этанола на 24 часа. Затем, поочередно образец помещают на 30 минут в 95% раствор этанола и изопропиловый спирт. Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал на 30 минут погружают в ксилол, обладающий способностью вытеснять спирт. Далее, соблюдая принцип постепенного замещения ксилола парафином, помещают объект в смесь из равных частей парафина и ксилола. Эта смесь, застывающая при комнатной температуре, при нагревании до 37°С расплавляется и приобретает жидкую консистенцию. Кусочки находятся в ксилоле-парафине при 56°С 30 минут - 1 час. Далее кусочки переносят на 3 часа в расплавленный парафин. После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином в парафиновые блоки. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leitz 1512 изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Для монтирования срезов использовали предметные стекла с адгезивным покрытием (Polysine-США). Перед окрашиванием парафиновые срезы депарафинизировали путем двукратного погружения стекол на 10 мин сначала в ксилол, а затем в изопропиловый спирт. Далее образцы поочередно погружали на 10 минут в 95- и 70%-ный раствор этанола. Высушивали на воздухе. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 50 минут с 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. После пятикратного промывания срезов в TBST проводили инкубацию с первичными антителами в течение 50 минут во влажной камере. В качестве первичных антител использовали коммерческие кроличьи поликлональные аффинно-очищенные антитела к лизилоксидазе (разведение 1:100). После пятикратного промывания срезов в TBST использовали вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (разведение 1:1000), в темноте при комнатной температуре в течение 50 мин. На заключительном этапе реакции срезы инкубировали в течение 10 мин с DAPI в концентрации 1 мкг/мл для окраски ядер. Оценка результатов проводилась на флуоресцентном микроскопе Nikon Diaphot 300 (увеличение ×40). Проводили подсчет клеток, содержащих лизилоксидазу, в единице поля зрения, равной 0,0384 кв. миллиметра, в трех различных областях среза с максимальным количеством клеток.

В группу исследования были включены 54 женщины, которые поступили в гинекологическое отделение ГКБ №33 для проведения гистероскопии и раздельного диагностического выскабливания матки. После получения результатов гистологического исследования соскобов из цервикального канала и полости матки все женщины были разделены на три группы.

I группа - 10 пациенток, у которых по данным морфологического исследования патологии эндометрия не выявлено, II группа - 24 женщины с железисто-кистозной гиперплазией эндометрия (простая и сложная без атипии) и III группа - 20 человек с простой и сложной гиперплазией эндометрия с атипией.

Выявлено, что между нормальным эндометрием и простой и сложной гиперплазией эндометрия не существует принципиальной разницы в количестве клеток, содержащих лизилоксидазу. Количество этих клеток составило от 17-48 клеток, в среднем 30 клеток на единицу поля 0,0384 мм². При атипической гиперплазии эндометрия количество клеток с лизилоксидазой в образцах составило от 50-69 клеток, в среднем 50 клеток на единицу поля зрения. Как следует из результатов, исследования количество клеток при атипической гиперплазии эндометрия составляет более 67% по отношению к норме и простой и сложной гиперплазии эндометрия. Значит, при увеличении числа клеток с лизилоксидазой в образце более 67% по отношению к норме, можно сделать вывод о наличии атипической гиперплазии эндометрия.

Пример 1.

Больная Гусева Р.И. 58 лет, поступила в гинекологическое отделение ГКБ №33 с диагнозом: Гиперплазия эндометрия (по данным УЗИ). Произведено раздельное диагностическое выскабливание матки. По описанной выше методике из полученного материала получен парафиновый блок. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leitz 1512 изготовили срезы толщиной 5 мкм. Для монтирования срезов использовали предметные стекла с адгезивным покрытием (Polysine-США). Перед окрашиванием парафиновые срезы депарафинизировали путем двукратного погружения стекол на 10 мин сначала в ксилол, а затем в изопропиловый спирт. Далее образцы поочередно погружали на 10 минут в 95- и 70%-ный раствор этанола. Высушивали на воздухе. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 50 минут с 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. После пятикратного промывания срезов в TBST провели инкубацию с первичными антителами в течение 50 минут во влажной камере. В качестве первичных антител использовали коммерческие кроличьи поликлональные аффинно-очищенные антитела к лизилоксидазе (разведение 1:100). После пятикратного промывания срезов в TBST использовали вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (разведение 1:1000), в темноте при комнатной температуре в течение 50 мин. На заключительном этапе реакции срезы инкубировали в течение 10 мин с DAPI в концентрации 1 мкг/мл для окраски ядер. Оценка результатов проводилась на флуоресцентном микроскопе Nikon Diaphot 300 (увеличение ×40). Провели подсчет клеток с лизилоксидазой в трех различных областях с макимальным содержанием клеток. Результат - число клеток с лизилоксидазой более 67% по отношению к норме (52 клетки на единицу поля зрения), что соответствует атипической гиперплазии. По данным гистологического исследования - атипическая гиперплазия эндометрия.

Пример 2.

Бальная Исаева О.Р. 43 лет, поступила в гинекологическое отделение ГКБ №33 с диагнозом: Маточное кровотечение позднего репродуктивного периода. Произведено раздельное лечебно-диагностическое выскабливание матки. Изготовление парафиновых блоков проведено по описанной выше технологии. Метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием специфических поликлональных антител к лизилоксидазе - см. пример 1. При подсчете клеток с лизилоксидазой в срезе получили - на 37% больше клеток по отношению к норме (в среднем 41 клетка на единицу поля зрения), что указывает на отсутствие атипической гиперплазии эндометрия. По результатам гистологического исследования - железисто-кистозная гиперплазия эндометрия - сложная форма.

Сравнение точности предлагаемого способа диагностики атипической гиперплазии эндометрия со способом, взятым в качестве прототипа, показало, что заявляемый способ на 11% по точности выше, чем способ по прототипу.

Заявленное изобретение относится к медицине и описывает способ диагностики атипической гиперплазии эндометрия, заключающийся в определении количества клеток с лизилоксидазой методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфических поликлональных антител к лизилоксидазе и при увеличении этих клеток более чем на 67% по отношению к норме, делают вывод о наличии атипической гиперплазии эндометрия. Данный способ позволяет повысить точность диагностики заболевания.

Способ диагностики атипической гиперплазии эндометрия, заключающийся в том, что методом непрямой иммунофлюоресценции определяют количество клеток с лизилоксидазой на единицу поля зрения в парафиновых срезах эндометрия после обработки специфическими поликлональными антителами к лизилоксидазе и при увеличении клеток более чем на 67% по отношению к норме делают вывод о наличии атипической гиперплазии эндометрия.