СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СВОБОДНОГО ГЕПАРИНА В КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к скотоводству, ветеринарии, и предназначено для определения количества свободного гепарина в крови крупного рогатого скота.

В определении гепарина известно несколько способов. Метод [1] /Sigg. c, 1952 В.П.Балуда, З.С.Баркаган и другие. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. - Томск, 1960, с. 129-131/ основан на исследовании влияние определенных количеств гепарина на время рекальцификации цитратной или оксалатной плазмы. Тест отражает состояние общей коагуляционной активности крови - содержание в последней плазменного кофактора гепарина (актитромбин 111), выявляется наиболее значительный сдвиг в сторону гиперкоагуляции.

Данная методика не дает возможности определить количество свободного гепарина в крови.

Известен метод Сирмаи Э. /1958/ [2] / Коблов Л.Ф. Методы и приборы для исследования гемостаза - М.: Медицина, 1975, с. 35-36/. Он позволяет определить количество свободного гепарина в крови человека (таб. N1) и является ближайшим аналогом.

Данная методика не позволяет определить свободный гепарин в крови крупного рогатого скота и его изменения.

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения количества свободного гепарина в крови крупного рогатого скота. Указанная цель достигается путем добавления в пробирки 0,1%-ного раствора толуидинового синего в увеличивающейся концентрации, изотонического раствора хлорида натрия и гепаринизированной венозной крови, термостатирования пробирок, визуального определения пробирки со свернувшейся кровью и определение количества свободного гепарина по формуле, отличающейся тем, что добавляют 0,1%-ный раствор толуидинового синего в разных разведениях в количестве от 0,01 мл до 0,12 мл, который доводят изотоническим раствором хлорида натрия до 0,5 мл, а определение ведут во формуле
СГ_кр = 2 • X • 0,14 - 1,95
где CГ_кр - количество свободного гепарина в крови, мкг/мл;
X - количество 0,1%-ного толуидинового синего в пробирке, мкг;
2; 0,14 и 1,95 - постоянные коэффициенты.

Пример выполнения способа.

Уменьшение количества раствора толуидинового синего, в среднем 1,9 раза, в разных разведениях связан с тем, что в пробирках с большим его содержанием проба крови свертывалась. Это говорит о меньшем содержании свободного гепарина в крови крупного рогатого скота по сравнению с кровью человека и невозможности использовать ряд разведений по Сирмаи Э. В результате наших экспериментальных исследований установлено, что оптимальным является ряд разведений, представленный в табл. N2. Дальнейшее уменьшение количества 0,1%-ного раствора толуидинового синего нецелесообразно, так как такое малое содержание не встречалось при исследованиях.

Увеличение количества 0,1%-ного раствора толуидинового синего более 0,12 мл также нецелесообразно, так как с таким содержанием не было ни одного животного. Во всех исследованиях 340 пробах крови содержание свободного гепарина находилось в пределах середины нашего ряда разведений.

Предлагаемая Сирмаи Э. доведение общего объема раствора до 0,8 мл не давала возможности определять количество свободного гепарина в крови крупного рогатого скота. Поэтому нами экспериментально установлено, что оптимальным является доведение общего объема до 1,0 мл и с этим связано увеличение количества изотонического раствора натрия хлорида в пробирках.

При определении количества свободного гепарина в крови крупного рогатого скота применяли ряд разведений 0,1%-ного раствора толуидинового синего в возрастающей концентрации: 0,01 - 0,03 - 0,05 - 0,06 - 0,07 - 0,09 - 0,10 - 0,12 мл и изотонического раствора натрия хлорида до 0,5.

В каждую пробирку дополнительно вносили по 0,5 мл венозной гепаринизированной крови обследуемого животного, содержащей 0,25 МЕ или 1,25 мкг гепарина в 1 мл. Содержимое пробирок перемешивали и ставили на 60 минут в термостат при 37^oC. После чего визуально определяли пробирку со свернувшейся кровью.

Количество гепарина в 1 мл крови в мкг определяли по формуле
СГ_кр = 2 • X • 0,14 - 1,95
где СГ_кр - содержание свободного гепарина в крови, мкг/мл;
X - количество толуидинового синего в пробирке, мкг;
2; 0,14 и 1,95 - постоянные коэффициенты.

Приводим все возможные варианты расчетов с использованием нашей формулы:
а) При свертывании крови во всех восьми пробирках
СГ_кр = 2 • 10 • 0,14 - 1,95 = 20 • 0,14 - 1,95 = 0,85 мкг/мл,
б) При свертывании крови в семи пробирках, кроме первой,
СГ_кр = 2 • 30 • 0,14 - 1,95 = 0,45 мкг/мл,
в) При свертывании крови в шести пробирках, кроме первой и второй,
СГ_кр = 2 • 50 • 0,14 - 1,95 = 12,05 мкг/мл,
г) При свертывании крови в пяти пробирках, кроме первых трех,
СГ_кр = 2 • 60 • 0,14 - 1,95 = 14,55 мкг/мл,
д) При свертывании крови в четырех пробирках, кроме первых четырех,
СГ_кр = 2 • 70 • 0,14 - 1,95 = 17,65 мкг/мл,
е) При свертывании крови в трех пробирках, кроме первых пяти,
СГ_кр = 2 • 90 • 0,14 - 1,95 = 23,25 мкг/мл,
ж) При свертывании крови в двух пробирках, кроме первых шести,
СГ_кр = 2 • 100 • 0,14 - 1,95 = 20,05 мкг/мл,
з) При свертывании крови только в последней (восьмой) пробирке
СГ_кр = 2 • 120 • 0,14 - 1,95 = 31,05 мкг/мл.

Изобретение относится к ветеринарии. Количество свободного гепарина. в крови крупного рогатого скота определяют способом, при котором в пробирки добавляют 0,1%-ный раствор толуидинового синего в увеличивающейся концентрации в разных разведениях в количестве 0,01 - 0,12 мл. Полученный раствор доводят изотоническим раствором хлорида натрия до 0,5 мл и добавляют в пробирки гепаринизированную венозную кровь. Пробирки термостатируют. Визуально определяют пробирку со свернувшейся кровью и рассчитывают количество свободного гепарина. по формуле СГ_кр = 2X • 0,14 -1,85, где СГ_кр - количество свободного гепарина в крови мкг/мл; Х - количество 0,1%-ного толуидинового синего в пробирке мкг, 2; 0,14 и 1,95 - постоянные коэффициенты. 2 табл.

Способ определения количества свободного гепарина в крови крупного рогатого скота путем добавления в пробирки 0,1%-ного раствора толуидинового синего в увеличивающейся концентрации, изотонического раствора хлорида натрия и гепаринизированной венозной крови, термостатирования пробирок, визуального определения пробирки со свернувшейся кровью и определения количества свободного гепарина по формуле, отличающийся тем, что добавляют 0,1%-ный раствор толуидинового синего в разных разведениях в количестве 0,01 - 0,12 мл, который доводят изотоническим раствором хлорида натрия до 0,5 мл, а определение ведут по формуле
СГ_кр = 2 • Х • 0,14 - 1,95,
где СГ_кр - количество свободного гепарина в крови, мкг/мл;
Х - количество 0,1%-ного толуидинового синего в пробирке, мкг;
2; 0,14 и 1,95 - постоянные коэффициенты.