Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита Советский патент 1992 года по МПК G01N33/74 

СО

с

Изобретение относится к медицине, а именно ревматологии, и может быть использовано для диагностики юванильного ревматоидного артрита. С целью повышения точности диагностики и упрощения способа, основанного на исследовании спонтанной активности лимфоцитов периферической крови ин витро, определяют спонтанную активность лимфоцитов в присутствии преднизолона в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, и при увеличении активности по сравнению с исходной диагностируют ювенильный ревматоидный артрит. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ювенильного. ревматоидного артрита.

Целью изобретения является повышение точности диагностики и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для оценки влияния преднизолона на спонтанную активность клеток периферической крови используют метод культивирования цельной крови в микроплатах. Для исследования используют культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл). На 100 мл этого раствора добавляют 3%-ный глюта- мин (1 мл); 7,5%-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10%-ныЙ хлористый кальций {0,07 мл) и 40%-ную глюкозу (0,25 мл). Гепаринизированную венозную кровь (25-30 ед. гепарина на 1 мл крови) смешивают с 10%-ным желатином в отношении 5:1 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Лейковзвесь снимают, производят подсчет общего числа лейкоцитов и разводят культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс./мл. 0,15 мл этой суспензии вносят в каждую лунку полистиролового 96-луночно- го v-образного планшета для иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн. аутологических эритроцитов на лунку. Для каждого больного ставят по 6 культур. В половину культур вносят преднизолон в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, другие три культуры служат контролем без преднизолона. Затем культуры имкубируют при 37°С в атмосфере абсолютной влажности с 5 % СОа (в С02 - инкубаторе Flow , Велико-, британия) в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносят радиоактивную метку (0,4 мкКи 3Н-тимидина на лунку). Пои

еле окончания инкубации культуры снимают с помощью коллектора с осаждением и промывкой клеток на фильтрах. Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивают, помещают в счетные флаконы со сцинтиллятором и просчитывают на сцинтилляционном счетчике Ракбета (1KB, Швеция). Сцинтиллятор готовят следующим образом: на 1 л толуола берут 5 г 2,5-дифенилоксазола (ППО) и 100 мг 1,4-ди- 2-{5-фенилоксазолил)-бензола (ПОПОП). ПОПОП предварительно смешивают с 100- 200 мл толуола и в течение 20-30 мин греют на водяной бане под ватно-марлевой пробкой до полного растворения. Компоненты смешивают и сцинтиллятор выдерживают в темноте в течение 1-2 сут, после чего используют, внося по 5 мл на счетный флакон. Оценку функциональной активности лимфоцитов проводят по спонтанному синтезу ДНК лимфоцитами периферической крови; что учитывают по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов и выражают числом импульсов в минуту. После получения результатов со счетчика вычисляют среднее значение показателя включения метки для культур без препарата (с ошибкой средней) и границы доверительного интервала для этих показателей спон- танной функциональной активности лимфоцитов периферической крови каждого больного с вероятностью Р 0,95 по методу определения доверительной зоны линейной регрессии. Вычисляют также средний показатель включения метки в ДНК в присутствии преднизолона также для каждого больного. Этот, показатель сравнивают с границами доверительного интервала показателей спонтанной активности лимфоцитов, без преднизолона для анализируемого больного. Если показатели спонтанной активности лимфоцитов в присутствии преднизолона выше верхней границы или ниже нижней границы вычисленного доверительного интервала, то говорят о достоверном изменении функ- циона льной активности лимфоцитов под влиянием преднизолона. Если показатель спонтанной активности лимфоцитов в присутствии преднизолона находится в преде- лах доверительного интервала, то преднизолон не оказывает достоверного влияния на спонтанную активность лимфоцитов. В этом случае говорят об отсутствии влияния преднизолона на спонтанный син- тез ДНК или об отсутствии чувствительности клеток периферической крови к преднизолону.

Пример 1. Больная КоржаеваЕ., 1983 г. рождения, поступила в кардиоревматологическое отделение 02.12.87 г, Из анамнеза известно, что девочка заболела 1,5 года назад, когда после травмы появилась болезненность при ходьбе и отечность левого голеностопного сустава. Лечилась амбула- торно нестероидными противовоспалительными средствами. На протяжении заболевания отметили присоединение пя- стно-фалангового сустава 2-го пальца правой руки. При поступлении суставы дефигурированы,отмечалось ограничение подвижности. При отфальмологическом обследовании выявлен правосторонний увеит. Было проведено обследование по предлагаемому способу сразу при поступлении в стационар. Для исследования использовали культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл). На 100 мл этого раствора добавляли 3 %-ный глютамин (1 мл); 7,5%-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10%-ный хлористый кальций (0,07 мл); 40%-ную глюкозу (0,25 мл). Гепа- ринизированную (25-30 ед.гепарина на 1 мл крови) венозную кровь смешивали с 10%- ным желатином в отношении 5:1 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Лейковзвесь снимали, производили подсчет общего числа лейкоцитов и лимфоцитов и разводили культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс/мл. 0,15мл этой суспензии вносили в каждую лунку полистиролового 96-луночного v-образного планшета для иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн аутологич- ных эритроцитов на .лунку. Для каждого больного ставили по 6 культур. В половину культур вносили преднизолон в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, другие три культуры служили контролем без преднизолона. Затем культуры инкубировали при 37°С в атмосфере абсолютной влажности с 5% С02 в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносили радиоактивную метку (0,4 мкКи 3Н-тимидина на лунку). После окончания, инкубации культуры снимали с помощью коллектора с осаждением и промывкой культур клеток на фильтрах. Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивали, помещали в счетные флаконы со сцинтиллятором и просчитывали на сцинтилляционном счетчике. Использовали сцинтиллятор следующего состава: на 1л толуола 5 г ППО и.100 мг ПОПОП. На счетный флакон вносили по 5 мл сцинтиллятора. Оценку функциональной активности лимфоцитов проводили по спонтанному синтезу ДНК лимфоцитами периферической крови. что учитывали по включению радиоактивной

метки в ДНК лимфоцитов и выражали числом импульсов в минуту.

После получения результатов со счетчика вычисляли среднее значение показателя включения метки для культур без препарата и границы доверительного интервала для этих показателей с вероятностью ,95 по методу определения доверительной зоны линейной регрессии. Вычисляли также средний показатель включения метки в ДНК в присутствии преднизолона. Получили результаты: спонтанный синтез ДНК лимфоцитами в культурах без преднизолона 577 имп/мин при доверительном интервале 514-640 имп/мин. Спонтанный синтез ДНК в культурах с преднизолоном 245 имп/мин. По данным обследования выявлено достоверное изменение (ингибиция) спонтанной активности лимфоцитов под влиянием преднизолона, на основании чего выстав- лен диагноз: ювенильный ревматоидный ар трит(ЮРА).

Проведено обследование по известно- му способу. В гепаринизированной крови производили подсчет общего числа .лей.кб- цитов и лимфоцитов. В культуру (общий объем 3 мл) вносили 5 х 105 лимфоцитов, что составило 0.2 мл цельной крови. Культу ральная среда состояла из среды 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и анти- биотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл культуральной среды). Смесь инкубировали при 37°С в течение 24 ч. За 5 ч. до окончания опыта в культуры вносили по 2 мкКи 3Н-тимидина в объеме 0,1 мл. На следующий день во флаконы добавляли 3%- ную уксусную кислоту (УК) для лизиса эритроцитов, содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки, флаконы промывали 3%-ной УК и смыв добавляли в цен- трифужные пробирки. Осажденные клетки ресуспендировали снова в 3%-ной УК и центрифугировали. После второго центрифугирования к осадку добавляли 5 мл холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты ), и пробирки выдерживали при 4°С в течение 30 мин до полного выделения из клеток кис- лоторастворимых фракций. После этого осадок дважды отмывали 5%-ной ТХУ. Кислотонераствримые фракции осаждали на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах. Высушенные фильтры с фиксирован- ным на них материалом помещали на дно флаконов для сцинтилляционного счетчика и заливали 5 мл сцинтилляционной жидко- сти следующего состава; 4 г ППО и 0,05 г ПОПОП на 1 л толуола. Пробы просчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике и результаты выражали числом импульсов за 1 мин.

При получении результатов со счетчика вычисляли средний показатель включения радиоактивной метки в ДНК лимфоцитов контрольной группы детей (10 человек), который составил 318±38 имп/мин. О значительном достоверном .повышении спонтанного синтеза ДНК у больного говорили при средних показателях, превышающих М ±1,56 группы здоровых детей (т.е. 489 имп/мин). Получены результаты: средний показатель спонтанной активности лимфоцитов больной составил 407 имп/мин, что не выше вычисленного предела М± 1,56 (489 имп/Мин) здоровых детей. Полученные данные отрицают диагноз ЮРА.

Контрольное комплексное обследование, пров.еденное с учетом клинико-лабора- торных, рентгенологических данных на основе критериев диагностики ЮРА,позволило поставить диагноз ЮРА. .

Таким образом, выявлено совпадение диагноза, поставленного предлагаемым способом, и несовпадение диагноза по известному способу с контрольным диагнозом.

Пример 2. Больная Дйденко И., 1974 г. рождения. Поступила) в кардиоревматоло- гическое отделение 23.10.87 г. с жалобами на болезненность при движении в лучезапя- стных суставах обеих рук. Из анамнеза известно, что девочка заболела 10 дней назад, когда через 20 дней после ожога появилась отечность и болезненность правого лучеза- пястного сустава, затем присоединился второй лучезапястный сустйв. При поступлении внешне суставы не изменены, местно- повышение температуры. Лабораторная ак- тивность невысокая (СОЭ 15 мм/ч, СРВ. 1+), рентгенологически изменений со стороны суставов не выявлено. За время нахождения в стационаре (1,5 месяца) получала лечение нестероидными противовоспалительными препаратами, проведён курс антибактериальной терапии с положительным эффектом.

Было проведено обследование по предлагаемому способу согласно, примеру Т. Получены результаты:: спонтанная активность лимфоцитов больной 242 имп/мин при доверительном интервале от 193-291, имп/мин с точностью Р 0,95. Показатель спонтанной активности лимфоцитов в присутствии преднизолона 204 имп/мин, т.е. не выходит за пределы вычисленного доверительного интервала. Полученные результаты отрицают диагноз Ю.РА.

Проведено обследование согласно известному способу аналогично примеру 1. Получены результаты: показатель спонтанного синтеза за ДНК в лимфоцитах больной

495 имп/мин, т.е. по сравнению с вычисленным пределом М ± 1,56 здоровых детей (489 имп/мин) показатель повышен,.что предполагает диагноз ЮРА.

Комплексное контрольное обследование при выписке позволило поставить девочке диагноз: реактивный артрит (послеожоговый), т.е. диагноз ЮРА был отвергнут.

Таким образом, данный пример демонстрирует повышение точности диагностики предлагаемым способом по сравнению с известным, так как отмечалось совпадение диагноза по предлагаемому способу с контролем. Диагноз, поставленный согласно известному способу, не совпал с контрольным.

Примерз. Больной Уразгалиев А., ,1975 г. рождения, поступил 08.01.88 г. Заболел 2,5 месяца назад, когда через 2 недели после перенесенной ОРВИ появилась отечность и болезненность правого коленного сустава. Сустав дефигурирован, болезненный при пальпации, утренняя скованность длится 15 мин. Лабораторная активность высокая (СОЭ 42 мм/ч, СРВ 3+), выявлен РФ в сыворотке в титре 1:128 реакцией Ваалер- Розе. Рентгенологические изменения в суставе соответствуют I ст. по Штейнброкеру.

При поступлении проведено обследование по предлагаемому способу аналогично примеру 1. Получены результаты: спонтанный синтез ДНК лимфоцитами 389 имп/мин при доверительном интервале от 345-433 имп/мин. Спонтанная активность лимфоцитов больного в культуре с преднизолоном 488 имп/мин. Полученные данные демонстрируют наличие стимулирующего влияния преднизолона у данного больного, что предполагает диагноз ЮРА.

Проведено обследование согласно известному способу аналогично примеру 1. Получены результаты: спонтанный синтез ДНК 803 имп/мин, что превышает показатель М ±1,56 контрольной группы детей, равный 489 имп/мин. Полученные данные позволяют поставить диагноз ЮРА.

Проведено комплексное обследование, на основании которого мальчику выставлен

диагноз ЮРА (контрольный диагноз).

Таким образом, отмечается совпадение диагноза, поставленного по предлагаемому и известному способам, с контрольным диагнозом;

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики на 41 % за счет возможности выявления раз- балансировэнности системы иммунорегуля- ций, характерной для ЮРА, и упростить

способ за счет исключения необходимости обследования контрольной группы здоровых детей.

В табл. 1 дана оценка точности диагностики ЮРА при использовании предлагаемого способа; в табл 2 - то же, при известном способе, в табл. 3 - сравнитель- ная.Оценка способов.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита путем исследования спонтанного синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови ин витро, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики ,

: периферическую кровь обрабатывают преднизолоном в концентрации 0,1 мкг/мл и при изменении спонтанного синтеза ДНК в пробе после обработки преднизолоном диагностируют ювеиильный ревматоидный артрит.

Таблица

Таблиц а2

Т а б л и ц-а 3