СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/00 C12N1/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технологии получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот, и может быть использовано в биотехнологических производствах для получения целевых продуктов и продуктов расщепления нуклеиновых кислот.

Известны различные способы снижения содержания нуклеиновых кислот в биомассе микроорганизмов путем их расщепления нуклеазами [1], которые находят применение в микробиологической промышленности.

Известен также способ [2] получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот за счет внутриклеточных нуклеаз, согласно которому отмытые водой клетки концентрируют до 5-15 мас.% путем центрифугирования, затем аэрируют при ≈30^oC и доводят pH до 4 5%-ным раствором NH₄OH, выдерживают биомассу до начала возрастания значения pH без добавления NH₄OH, нагревают биомассу до 50-55^oC, продолжая аэрировать, поддерживая молярность буферным раствором до 0,05-1,0 М или посредством ЭДТА до 0,01 М, затем повышают pH до 5,0-5,5 добавлением HCl или CH₃COOH, и выдерживанием в тех же условиях в течение 1-3 ч, после чего биомассу отделяют на центрифуге и высушивают. Недостатком указанного способа является его многостадийность и применение дорогостоящего препарата ЭДТА, что исключает его широкое использование в промышленных условиях. Кроме того, при проведении процесса снижения содержания нуклеиновых кислот температуру не поднимают выше 55^oC, вследствие чего происходит потеря белка из-за активности протеаз.

Более близким к предлагаемому является способ получения дрожжей с низким содержанием нуклеиновых кислот [3], согласно которому исходную биомассу нагревают на кипящей водяной бане в течение 15-30 мин, затем охлаждают до 37-40^oC, обрабатывают гидролизирующим агентом - ферментным препаратом из Actinomyces coelicolor ВКПМ-S-464 и ведут гидролиз при pH 9,0-10,5 в присутствии (S - 10) • 10^-3 М 5•10^-3 М - 1•10^-2 М хлористого магния в течение 5-6 ч, после чего биомассу отделяют от жидкой фазы.

Недостатком этого способа, принятого за прототип, является использование для расщепления нуклеиновых кислот двухферментного препарата - 5-экзонуклеазы и щелочной фосфотазы, а также большая продолжительность гидролиза (5-6 ч), что приводит к значительному удорожанию процесса.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является снижение содержания нуклеиновых кислот и выделение продуктов из гидролиза без использования дорогостоящих ферментных препаратов и реактивов при сокращении длительности процесса.

Технический результат достигается предлагаемым способом получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот, включающим нагрев исходной биомассы, ее последующее охлаждение и гидролиз нуклеиновых кислот, а также отделение полученного целевого продукта на завершающей стадии от жидкой фазы с последующим его концентрированием и высушиванием, в котором нагрев производят при 75-90^oC в течение 5-30 мин, охлаждение биомассы и гидролиз нуклеиновых кислот ведут при 30-35^oC в течение 90-120 мин, выделение продуктов гидролиза проводят посредством повторного нагрева биомассы при 75-85^oC, pH среды 1,0-1,5 в течение 30-60 мин, а перед отделением целевого продукта от жидкой фазы pH среды повышают до 4-5.

Согласно предлагаемому способу нагрев при 75-90^oC в течение 5-30 мин исключает нежелательное расщепление белка протеазами и обеспечивает активацию латентных нуклеаз.

Охлаждение биомассы до 30-35^oC с последующей инкубацией в течение 90-120 мин создает благоприятные условия для проведения активности внутриклеточных нуклеаз с последующим расщеплением нуклеиновых кислот до низкомолекулярных соединений.

Повторное нагревание биомассы до 75-85^oC при pH 1,0-1,5 в течение 30-60 мин способствует выходу из клеток в культуральную жидкость продуктов расщепления нуклеиновых кислот.

Перед отделением целевого продукта и продуктов расщепления нуклеиновых кислот pH среды доводят до значений 4-5, что повышает надежность целевого продукта.

Указанная совокупность операций предлагаемого способа и условий его осуществления является новой, не известной из уровня техники, и обеспечивает достижение технического результата, т.к. позволяет получать продукты повышенного биологического качества с низким содержанием нуклеиновых кислот без использования дорогостоящих реактивов и препаратов. Значительное сокращение длительности технологического процесса в 2-2,5 раза по сравнению с прототипом (базовым объектом) и простота его аппаратурного оформления также приводят к удешевлению процесса и возможности его широкого промышленного применения.

Наконец следует отметить, что предложенное техническое решение даже для специалистов явным образом не следует из уровня техники, т.е. имеет изобретательский уровень, и таким образом, оно удовлетворяет всем условиям патентоспособности.

Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, выращенные на синтетической среде с глюкозой, суспендируют в водопроводной воде до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л, нагревают 20 мин при 75^oC, затем охлаждают до 30^oC и инкубируют при этой температуре в течение 2 ч. Затем pH суспензии доводят до 1 и снова нагревают при 80^oC в течение 60 мин. Затем pH среды повышают до 5, разводят ее до концентрации 10 г сухой биомассы на 1 л. Далее клетки дрожжей отделяют центрифугированием и определяют в них содержание нуклеиновых кислот, оно составляет 0,6% против 9,20% в контроле.

Пример 2. Дрожжи Candida tropicalis ИБФМ-303, выращенные на синтетической солевой среде с источником углерода -2% смеси парафинов (C₁₁-C₂₄) - сепарируют до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л и нагревают 30 мин при 85^oC, затем охлаждают до 35^oC и выдерживают при этой температуре (низкой) в течение 1,5 ч. После этого в суспензию дрожжей добавляют концентрированную соляную кислоту до pH 1,0 и нагревают 30 мин при 75^oC. Затем pH среды повышают до 5 при помощи NaOH и разводят ее водопроводной водой до концентрации 10 г сухой биомассы на 1 л. Далее биомассу сепарируют и определяют в ней содержание нуклеиновых кислот методом двуволновой спектрофотометр. Содержание нуклеиновых кислот снижается до 0,8% по сравнению с 5,6% в контроле.

Пример 3. Клетки Methylosinus trisporium, выращенные на метане как источнике углерода, имеют низкое содержание нуклеиновых кислот - 2,8%. После стандартной обработки клеток (нагревание 5 мин при 90^oC, последующая инкубация при 34^oC в течение 2 ч и повторное нагревание при 85^oC в среде с pH 1,5 в течение 30 мин), их количество снижается до 0,30% по сравнению с 2,8% в контроле.

Параметры процесса получения биомассы с низким содержанием нуклеиновых кислот представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, продолжительность процесса снижения нуклеиновых кислот в 2,0-2,5 раза меньше, чем в прототипе.

В табл. 2 представлена характеристика качества получаемого продукта. Из табл. 2 видно, что остаточное содержание нуклеиновых кислот в предлагаемом способе в 3 раза меньше, чем в прототипе, что свидетельствует о большой эффективности процесса.

Источники информации
1. Баскакова А. А., Безбородова С.И., Беляева М.И. и др. Нуклеаза микроорганизмов. - М.: Наука, 1974, с. 188-249, 277-279.

2. Патент ФРГ N2208279, кл. C 12 N 13/06, 1980.

3. Авторское свидетельство N 1558979, кл. C 12 N 1/08, 1990.

Способ включает нагрев исходной биомассы при 75-90^oC, последующую инкубацию при охлаждении до 30-35^oC и отделение полученного продукта. Выделение продуктов гидролиза проводят нагревом биомассы при 75-85^oC и 1,0-1,5 в течение 30-60 мин, а перед отделением целевого продукта от жидкой фазы pН среды повышают до 4-5. Продукты концентрируют и высушивают. Техническим резупьтатом является снижение содержания нуклеиновых кислот и выделение продуктов без использования дорогостоящих ферментных препаратов при сокращении длительности процесса. 2 табл.

Способ получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот, включающий нагрев исходной биомассы, ее последующую инкубацию при охлаждении с гидролизом нуклеиновых кислот, а также отделение полученного продукта на завершающей стадии от жидкой фазы с последующим его концентрированием и высушиванием, отличающийся тем, что нагрев проводят при 75-90^oC в течение 5-30 мин, инкубирование биомассы с гидролизом нуклеиновых кислот ведут при 30-35^oC в течение 90-120 мин, выделение продуктов гидролиза проводят посредством повторного нагрева биомассы при 75-85^oC и pH среды 1,0-1,5 в течение 30-60 мин, а перед отделением целевого продукта от жидкой фазы pH среды повышают до 4-5.