СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/102 C12N1/20 C12N5/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственному производству и может быть использовано при промышленном производстве живых и инактивированных вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц.

Известны способы получения вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц (1, 2).

Существующие способы изготовления вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц обладают серьезными недостатками: культивирование микроорганизмов проводят в среде на основе дорогостоящего и дефицитного пищевого белка - мясного гидролизата по Хоттингеру; препараты, изготовленные с применением этого гидролизата, не обладают достаточной стабильностью, нестандартны, себестоимость их производства высокая.

Технической задачей изобретения является замена пищевого мясного сырья в качестве основы питательной среды на гидролизат из отходов мясного производства при изготовлении вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц для обеспечения стабильности биологических свойств препаратов и снижения их себестоимости.

Она достигается за счет того, что периодическое управляемое выращивание пастерелл проводят в более дешевой питательной среде на основе сухого белкового концентрата (СБК) (3), содержащей экстракт кормовых дрожжей (ФС 42-386 ВС 91), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77), натрий фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 4172-76), растворенные в дистиллированной воде (ГОСТ 6709-72). Промышленное производство СБК, представляющего собой продукт переработки специального мясо-костного бульона, позволяет получить дешевый и стандартный продукт с высоким содержанием белка (до 95%), обеспечивающий стабильное высокое накопление выращиваемых микроорганизмов. В гидролизате СБК содержится 27 аминокислот по сравнению с 18 аминокислотами в мясном переваре. Культивирование пастерелл проводят с регулированием pH, парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода (pO₂), окислительно-восстановительного потенциала (eH) и дробной подачи глюкозы. Полученную культуру концентрируют, фасуют во флаконы и лиофолизируют (живые вакцины) или инактивируют, смешивают с адъювантом и фасуют во флаконы (инактивированные вакцины).

Способ осуществляется следующим образом. В стерильный ферментер загружают питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 4,5-6,0
Экстракт кормовых дрожжей - 0,2-0,8
Натрий хлористый - 0,1-0,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3-1,3
Вода дистиллированная - Остальное
Питательную среду в ферментере засевают культурой одного из производственных штаммов пастерелл (Pasteurella multocida, штаммы - "AB", "К", А-1231, В-681, Д-Т-80 и др. ), выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют при температуре (37±1)^oC в течение 6-8 ч в соответствии с известным алгоритмом управления процессом: регулированием pH, парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода (pO₂), окислительно-восстановительного потенциала (eH) и дробной подачи глюкозы (1).

Полученную культуру концентрируют, фасуют во флаконы (живые вакцины) пли инактивируют, смешивают с адъювантом и фасуют во флаконы (инактивированные вакцины). Примеры осуществления способа
Пример 1. Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 4,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,2
Натрий хлористый - 0,1
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3
Вода дистиллированная - Остальное
Питательная среда содержит 150,0 мг% аминного азота и имеет pH 7,8-8,0. До засева pH питательной среды доводят до 8,2-8,6 10% раствором гидроокиси натрия. Среду засевают культурой пастерелл (Pasteurella multocida), выращенной в жидкой тщательной среде аналогичного состава, и культивируют при температуре (37±1)^oC в течение 6-8 ч.

Засеянную культуру выдерживают на уровне насыщения растворенного в питательной среде кислорода pO₂ 0-5% от насыщения (без аэрации) до достижения значения окислительно- восстановительного потенциала (eH) минус 150-30 мВ. Затем включают мешалку и аэрацию для поддержания pO₂ на уровне (15±5)%. Расход воздуха постепенно увеличивают до 1,5 объемов в мин на объем среды (культуры). pH культуры в течение 2-3 ч снижается до 8,0, после чего включают регулирование pH с помощью автоматической подачи 10% раствора гидроокиси натрия и стабилизируют pH на этом уровне до окончания выращивания. Одновременно повышают pO₂ до (35±5%%).

В раствор глюкозы: через 1,5 и 3 ч подают 0,3% раствора глюкозы в пересчете на объем культуры. В дальнейшем глюкозу подают теми же дозами при лимитировании роста, характеризующемся прекращением снижения pH культуральной жидкости и значительным увеличением pO₂ при постоянной аэрации. При обильном ценообразовании подают стерильный пеногаситель - пропинол Б-400 из расчета 0,001-0,003%.

Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 10,2 млрд. микробных клеток (м. к. ). Полученную культуру инактивируют, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (моновакцина) или смешивают с другими инактивированными культурами пастерелл или других микроорганизмов, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (поливалентная вакцина). Культуры других штаммов пастерелл получают аналогичным способом. Вакцина безвредна и иммуногенна.

Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 5,25
Экстракт кормовых дрожжей - 0,50
Натрий хлористый - 0,30
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,80
Вода дистиллированная - Остальное
Питательная среда содержит 175,0 мг% аминного азота. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 21,6 млрд.м.к. Полученную культуру инактивируют, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (моновакцина) или смешивают с другими инактивированными культурами пастерелл или других микроорганизмов, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (поливалентная или комплексная вакцина). Культуры других штаммов пастерелл получают аналогичным способом. Вакцина стабильна по физико-химическим и биологическим свойствам, в т.ч. по безвредности и иммуногенности.

Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 6,0
Экстракт кормовых дрожжей - 0,8
Натрий хлористый - 0,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,3
Вода дистиллированная - Остальное
Питательная среда содержит 200,0 мг% аминного азота. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 14,1 млрд.м.к. Полученную культуру инактивируют, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (моновакцина) или смешивают с другими инактивированными культурами пастерелл или других микроорганизмов, добавляют адъювант и фасуют во флаконы (поливалентная или комплексная вакцина). Культуры других штаммов пастерелл получают аналогичным способом. Вакцина безвредна и иммуногенна.

Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 4,0
Экстракт кормовых дрожжей - 0,10
Натрий хлористый - 0,05
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,20
Вода дистиллированная - Остальное
Питательная среда содержит 100,0 мг% аминного азота. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 5,3 млрд. м.к. В полученной культуре наблюдали полиморфизм.

Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 6,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,9
Натрий хлористый - 0,6
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,4
Вода дистиллированная - Остальное
Питательная среда содержит 217,0 мг% аминного азота. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 8,5 млрд.м.к. В полученной культуре наблюдали полиморфизм.

Технологические параметры изготовления поливалентной вакцины против пастереллеза животных и птиц приведены в таблице.

Аналогичные результаты получены при изготовлении других инактивированных и живых моно-, поливалентных и комплексных вакцин.

Преимущества заявляемого способа перед известным.

Применение в изготовлении живых и инактивированных вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц питательной среды на основе гидролизата СБК позволяет получить стабильные по физико-химическим и биологическим свойствам препараты, не уступающие по безвредности и иммуногенности вакцинам, выпускаемым с использованием мясных гидролизатов.

Использование среды на основе гидролизата СБК обеспечивает снижение себестоимости вакцин за счет исключения из технологического процесса дорогостоящего пищевого мясного сырья.

Источники информации, принятые во внимание:
1. Патент РФ N 1566533, А 61 К 39/102, 03.06.1988.

2. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины поливалентной эмульгированной против пастереллеза свиней, утвержденная Главным управлением ветеринарии Агропрома СССР 13 ноября 1991 г.

3. Патент РФ N 2015673, A 23 K 1/00, 1/10, 31.07.92.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве живых и инактивированных вакцин против пастереллеза животных и птиц. Техническая задача изобретения - замена пищевого мясного сырья в качестве основы питательной среды на гидролизат из отходов мясного производства при изготовлении вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц. Способ заключается в следующем: глубинное культивирование пастерелл проводят в более дешевой питательной среде на основе гидролизата сухого белкового концентрата с регулированием рН, парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода и дробной подачей глюкозы. Полученную культуру концентрируют, фасуют во флаконы и лиофилизируют (живые вакцины) или инактивируют, смешивают с адъювантом и фасуют во флаконы (инактивированные вакцины) или используют для приготовления поливалентных и комплексных вакцин. Способ позволяет удешевить вакцину, улучшить стабильность и стандартность биологических свойств препаратов. 1 табл.

Способ изготовления вакцин против пастереллеза животных и птиц, включающий засев вакционного штамма пастерелл в жидкую питательную среду, содержащую белковый продукт животного происхождения, экстракт дрожжей, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный и воду дистиллированную, культивирование с последующим концентрированием и лиофилизацией или инактивацией бактериальной суспензии и смешиванием с адьювантом, отличающийся тем, что в жидкой питательной среде используют в качестве белкового продукта животного происхождения гидролизат сухого белкового концентрата, в качестве экстракта дрожжей - экстракт кормовых дрожжей, а компоненты среды берут в следующем соотношении, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата (по сухому веществу) - 4,5 - 6,0
Экстракт кормовых дрожжей - 0,2 - 0,8
Натрий хлористый - 0,1 - 0,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3 - 1,3
Вода дистиллированная - Остальное