СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве вакцины против лептоспироза животных.

Известны способы получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных [1, 2, 3] Однако существующие способы изготовления вакцины обладают рядом недостатков.

Используемая сывороточная питательная среда и рутинный способ культивирования лептоспир в стеклянной посуде не отвечают требованиям современного индустриального производства препарата, не обеспечивают высокого накопления бактериальной массы 70 100 млн/мл для получения высокоиммуногенной, стабильной и эффективной вакцины.

Применение стеклянных бутылей для культивирования лептоспир представляет весьма трудоемкий и тяжелый ручной труд. Многочисленные операции с бутылями при монтаже, при фильтровании среды, при посеве культуры лептоспир, при просмотре культуры на накопление, при перекачке культуры лептоспир для составления серии вакцины и др. приводит к контаминации отдельных бутылей посторонней микрофлорой, а в конечной итоге к удорожанию и снижению качества препарата. В настоящее время сказывается нехватка стеклянной посуды, ее дороговизна и относительно короткий срок эксплуатации.

Трудоемки и не надежны в промышленном производстве также процессы стерилизующего фильтрования среды и концентрирования баксуспензии (в следствие низкого накопления бактериальной массы).

Многолетний опыт показал, что основным недостатком сывороточной среды является содержание (у значительной части овец-доноров) специфических антител к производственным штаммам лептоспир, что приводит к снижению накопления этих микроорганизмов и изменению их антигенной структурны, а это в конечном итоге к снижению качества вакцины.

Наиболее близким аналогом является способ изготовления вакцины против лептоспироза животных, включающий посев лептоспир в синтетическую среду, содержащую аминокислоты, витамины В₁ и В₁₂, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, ПАВ (твин-80) и дистиллированную воду. Культивирование проводят в условиях аэрации и перемешивания с периодическим внесением твина-80 в процессе культивирования. Полученную бактериальную массу инактивируют и добавляют адъювант [4]
Цель изобретения получение высокого накопления бактериальной массы при культивировании лептоспир в биореакторе, повышение иммуногенности, стабильности и эффективности вакцины, а также снижение себестоимости препарата.

Цель достигается за счет использования разработанной бессывороточной питательной среды на твин-альбуминовой основе и разработанного режима культивирования лептоспир.

Кроме того, введение в состав питательной среды пролина, аспарагина и глутамина позволяет получать максимальное накопление лептоспир, а добавление фторурацила подавляет рост посторонней микрофлоры, не влияя на рост лептоспир, и обеспечивает чистоту культуры.

Способ осуществляется следующий образом.

В стерильные биореакторы загружают жидкую оптимизированную по составу для лептоспир (ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГНКИ-3, ВГНКИ-4, ВГНКИ-5, ВГНКИ-6) питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,15 0,3
Твин-80 (неонол) 0,01 0,03
L аспарагин 0,1 0,5
Фторурацил 0,01 0,025
Пролин 0,03 0,05
Глутамин 0,025 0,045
Витамин В₁ 0,03 0,05
Витамин В₁₂ 0,01 0,025
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 15,6 17,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 1,17 3,17
Вода дистиллированная до 100,0.

Готовая стерильная питательная среда должна содержать 0,15 0,3% белка и иметь 7,35 7,55 ед. pH.

Питательную среду в отдельном ферменте засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в течение 5 сут (120 ч) в жидкой питательной среде с сывороткой крови (5%) и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 27 29^oC в течение 72 90 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 200 - 180 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и включенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об/мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15 20% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости в процессе культивирования изменяется незначительно и его не регулируют. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,01 0,03% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином, смешивают между собой в одинаковых объемах, добавляют адъювант и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 1. Способ изготовления с минимальными значениями параметров.

В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают в жидкую оптимизированную по составу для лептоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,15
Твин-80 (неонол) 0,01
L аспарагин 0,1
Пролин 0,03
Глутамин 0,025
Фторурацил 0,01
Витамин B₁ 0,03
Витамин B₁₂ 0,01
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 15,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 1,17
Вода дистиллированная До 100,0
Готовая стерильная питательная среда содержит 0,15% белка и имеет 7,35 ед pH. Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 5 сут (120 ч) и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 27^oC в течение 72 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 200 мB путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затеи с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культурной жидкости кислорода на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твина-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,01% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Накопление лептоспир после 72 ч культивирования составляет 1 млрд/с³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, антигены смешивают между собой в равных количествах, добавляют 6% -ный гидрат окиси алюминия в количестве 30% от общего объема и стерильно фасуют во флаконы,
Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую оптимизированную по составу для липтоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,22
Твин-80 (неонол) 0,02
L аспарагин 0,3
Фторурацил 0,018
Пролин 0,04
Глутамин 0,035
Витамин B₁ 0,04
Витамин B₁₂ 0,018
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 16,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 2,17
Вода дистиллированная До 100,0
Питательная среда содержит до 0,22% белка и имеет 7,45 ед. pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава в течение 120 ч.

Культивируют каждый штамм отдельно при 28^oC в течение 81 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 190 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения подачи воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об/мин поддерживают парциальное давление растворенного в культурной жидкости кислорода на уровне 17,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твина-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,02% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реактор воздуха. Накопление лептоспир после 81 ч культивирования составляет 2 млрд/см³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных количествах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую оптимизированную по составу для лептоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,3
Твин-80 (неонол) 0,03
L аспарагин 0,5
Фторурацил 0,025
Пролин 0,05
Глутамин 0,045
Витамин В₁ 0,05
Витамин B₁₂ 0,025
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 17,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 3,17
Вода дистиллированная До 100,0
Питательная среда содержит 0,3% белка и имеет 7,55 ед.pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 120 ч и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 29^oC в течение 90 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до: 180 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об. /мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,03% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Накопление лептоспир после 90 ч культивирования составляет 1,5 млрд/см³
Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных объемах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,1
Твин-80 (неонол) 0,005
L аспарагин 0,05
Фторурацил 0,005
Пролин 0,02
Глутамин 0,015
Витамин B₁ 0,02
Витамин B₁₂ 0,005
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 14,5
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 0,99
Вода дистиллированная До 100,0
Готовая питательная среда содержит 0,10% белка и имеет 7,30 ед. pH
Питательную среду в отдельных биореакторах засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 120 ч. Культивируют каждый штамм лептоспир в отдельном биореакторе при 26^oC в течение 70 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 210 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 12,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,005% при лимитировании роста лептоспир характеризующимся резким повышением рО₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Накопление лептоспир после 70 ч культивирования составляет не выше 0,15 млрд клеток/мл.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены лептоспир между собой в равных объемах, добавляют 6% -ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,4
Твин-80 (неонол) 0,04
L аспарагин 0,6
Фторурацил 0,035
Пролин 0,055
Глутамин 0,055
Витамин В₁ 0,06
Витамин В₁₂ 0,03
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 18,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 4,17
Вода дистиллированная до 100,0
Готовая питательная среда содержит 0,4% белка и имеет 7,60 ед. pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в течение 120 ч в жидкой питательной среде указанного состава и культивируют при 30^oС в течение 92 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 170 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 22,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,04% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением рО₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Накопление лептоспир после 92 ч культивирования составляет 0,3 млрд/см³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных количествах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Технологические параметры культивирования лептоспир и сравнительные данные изготовления вакцины против лептоспироза животных, указанные в примерах, а также активность готового препарата, приведены в таблице.

Таким образом использование принципиально новой бессывороточной питательной среды на твин-альбуминовой основе и разработанного режима культивирования позволяет значительно увеличить накопление бактериальной массы при изготовлении вакцины против лептоспироза животных, а также повысить стабильность и срок годности препарата.

Источники информации:
1. Авторское свидетельство СССР N 555664, кл. А 61 К 39/00, 1983 г.

2. Авторское свидетельство СССР N 828459, кл. А 61 К 39/02, C 12 N 5/00, 1983 г.

3. Инструкция по изготовлению и контролю поливалентной вакцины "ВГНКИ" против лептоспироза животных, утв. 06.03.84.

4. Малахов Ю.А. Лептоспироз животных, М. ВО Агропромиздат, 1992, с.31-33.

Использование: биотехнология, вакцина против лептоспироза животных. Сущность изобретения: культуру лептоспир выращивают при 27 - 29^oC в течение 72 - 90 ч и парциальном давлении растворенного кислорода в пределах 15 - 20% от насыщения кислородом воздуха. Для культивирования используют жидкую питательную среду на твин-альбуминовой основе, при следующем соотношении компонентов, мас.%: альбумин сухой 0,15 - 0,3; неонол или твин-80 0,01 - 0,03; L-аспарагин 0,1 - 0,5; фторурацил 0,01 - 0,025; пролин 0,03 - 0,05; глутамин 0,025 - 0,045; витамин B₁ 0,03 - 0,05; витамин B₁₂ 0,01 - 0,025; натрий фосфорнокислый двузамещенный 15,6 - 17,6; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,17 - 3,17; вода дистиллированная до 100,0. Причем после засева лептоспир окислительно-восстановительный потенциал снижают до 180 - 200 мВ, а концентрацию неонола или твина-80 поддерживают на уровне 0,01 - 0,03 маc.% на протяжении всего процесса культивирования. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против лептоспироза животных, включающий посев лептоспир, их культивирование в жидкой питательной среде, содержащей аминокислоты и витамины В₁ и В_1 2, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, ПАВ и дистиллированную воду, в условиях аэрации и перемешивания, внесение ПАВ в процесс культивирования с последующей инактивацией бактериальной массы и добавлением адъюванта, отличающийся тем, что после посева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 180 200 мВ, культивирование проводят в течение 72 90 ч при температуре 27 29^oС и парциальном давлении растворенного кислорода в пределах 15 20% от насыщения кислородом воздуха в питательной среде, дополнительно содержащей альбумин сухой, фторурацил, из аминокислот - L-аспарагин, пролин, глутамин, из ПАВ неонол или твин-80, при следующем соотношении компонентов, мас.

Альбумин сухой 0,15 0,3
Неонол или твин-80 0,01 0,03
L-аспарагин 0,1 0,5
Фторурацил 0,01 0,025
Пролин 0,03 0,05
Глутамин 0,025 0,045
Витамин В₁ 0,03 0,05
Витамин В_1 2 0,01 0,025
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 15,6 17,6
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,17 3,17
Вода дистиллированная До 100,0
при этом концентрацию ПАВ поддерживают на уровне 0,01 0,03 мас. на протяжении всего процесса культивирования.