СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/102 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц.

Известен способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц (Патент SU 1566533 А1 А 61 К 39/102).

Существующий способ изготовления вакцины против пастереллеза обладает рядом недостатков: процесс культивирования ведется периодическим способом, при котором свойства клеток и состав культуральной среды значительно изменяются в ходе выращивания и который обладает низкой производительностью из-за большого числа подготовительных и вспомогательных операций, что сказывается на качестве препарата, а также на эффективности производства.

При анализе патентной документации и научно-технической литературы нами не обнаружено достаточно эффективного способа изготовления вакцин против пастереллеза, приближающегося к современному уровню производства биопрепаратов.

Целью заявляемого изобретения является увеличение продуктивности процесса культивирования по выходу морфологически типичных и жизнеспособных пастерелл с учетом гибели клеток при хранении вакцины, а также повышение качества препарата и стандартности биологических свойств вакцины.

Поставленная цель достигается за счет того, что процесс выращивания пастерелл проводят непрерывно-проточным хемостатным способом, т.е. с непрерывной подачей в ферментер определенных количеств питательной среды и раствора глюкозы, и также непрерывным сливом из аппарата такого же количества бактериальной суспензии, которая используется на последующих стадиях изготовления вакцины.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильный ферментер загружают жидкую питательную среду, изготовленную на основе мясного гидролизата. Среду засевают культурой пастерелл (Pasteurella multocida штаммы Пастеровский, К, AB, А-8683, В-681, Д-Т-80), выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют периодическим способом в течение 3-4 часов. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы суммарный объем поступающих за 1 час в ферментер питательной среды и раствора глюкозы составлял 0,5-0,9 объема суспензии в аппарате, а концентрация глюкозы в поступающей питательной среде была в пределах 1-5 г/л. Устройство слива по уровню при этом поддерживает постоянный объем бактерийной суспензии в аппарате. В ферментере стабилизируют pH культуральной жидкости на уровне 7,8-8,2 ед. подачей раствора NaOH, а парциальное давление растворенного кислорода (pO₂) на уровне 30-40% от насыщения кислородом воздуха - изменением расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки. После установления в ферментере постоянной концентрации пастерелл бактерийную суспензию используют для изготовления вакцины. В указанных пределах изменения скорости разбавления, концентрации глюкозы в питательной среде, pH и pO₂ рост пастерелл лимитируется источником углерода - глюкозой.

Пример 1.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с минимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 7,8 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 30% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (37±1)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,5 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 1 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины: Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 22,4 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию.

Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 11,2 млрд./мл•час, экономический коэффициент - 18,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл безвредна, иммуногенность составляет 95%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 53%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 5,9 млрд. микр. тел/мл•час.

Пример 2.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с оптимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,0 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 35% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (37±1)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,7 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 3 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 19,6 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 13,8 млрд./мл•час, экономический коэффициент - 6,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл безвредна, иммуногенность составляет 100%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 51,2%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 7,1 млрд. микр. тел/мл•час.

Пример 3.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" с максимальными значениями параметров. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,2 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 40% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (37±1)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,9 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 5 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл, баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 14,8 млрд./мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 13,0 млрд./мл•час, экономический коэффициент - 3,4 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, безвредна, иммуногенность составляет 100%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 45%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 5,85 млрд. микр. тел/мл•час.

Пример 4.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из.шт. "K" со значениями параметров ниже минимальных. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 7,5 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 15% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют в течение 3-4 часов при температуре (37±1)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 0,3 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 0,5 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 28,4 млрд. /мл, культура имеет типичную морфологию (короткие грамотрицательные палочки), стабильную ультраструктурную организацию. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 8,0 млрд./мл•час, экономический коэффициент - 30,0 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован глюкозой. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, безвредна, иммуногенность составляет 90%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 60%. Продуктивность с учетом, гибели клеток при хранении - 4,8 млрд. микр. тел/мл•час.

Пример 5.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" со значениями параметров выше максимальных. Для культивирования пастерелл используют жидкую питательную среду на основе мясного гидролизата с pH 8,5 ед., в процессе выращивания поддерживают pO₂ на уровне 55% от насыщения культуральной среды кислородом воздуха. Среду засевают культурой пастерелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и культивируют, в течение 3-4 часов при температуре (37±1)^oC. Затем включают проток стерильной питательной среды и раствора глюкозы таким образом, чтобы их суммарный объем, поступающий в аппарат за 1 час составлял 1,4 от объема баксуспензии в ферментере, а концентрация глюкозы в поступающей среде была 10 г/л. После установления в аппарате постоянной концентрации пастерелл баксуспензию используют для изготовления вакцины. Концентрация колониеобразующих пастерелл при этом составляет 12,0 млрд./мл, наблюдается полиморфизм клеток со стабильной ультраструктурной организацией. Продуктивность по выходу жизнеспособных пастерелл хемостатного процесса культивирования составляет 16,7 млрд. /мл•час, экономический коэффициент - 1,6 млрд. микробных тел/мг глюкозы. Рост пастерелл лимитирован не глюкозой, а другим неизвестным компонентом питания. Вакцина, изготовленная из хемостатной культуры пастерелл, реактогенна, иммуногенность составляет 95%. Стабильность при хранении в течение 3 месяцев - 21%. Продуктивность с учетом гибели клеток при хранении - 3,5 млрд. микр. тел/мл•час.

Технологические параметры изготовления серий сухой живой вакцины против пастереллеза птиц из шт. "K" приведены в таблице. Аналогичные закономерности наблюдаются и у других вышеупомянутых штаммов пастерелл.

Применение непрерывно-проточного хемостатного процесса культивирования при производстве вакцин позволяет повысить продуктивность процесса выращивания пастерелл по сравнению с периодическим способом выращивания не менее чем в 5 раз, уменьшить количество и продолжительность подготовительных операций, автоматизировать процесс культивирования, уменьшить затраты ручного труда, повысить качество препарата за счет того, что вакцины изготавливаются из стабильных по биологическим свойствам культур, выращенных с постоянными и точно определенными скоростью роста, концентрациями клеток, компонентов питательной среды и метаболитов.

Изобретение предназначено для промышленного производства вакцин против пастереллеза птиц и животных. Процесс выращивания пастерелл проводят непрерывно-проточным хемостатным способом с непрерывной подачей в ферментер определенных количеств питательной среды и раствора глюкозы. При этом непрерывно осуществляют слив из аппарата такого же количества бактериальной суспензии. Слитая бактериальная суспензия используется на последующих стадиях изготовления вакцины. Изобретение позволит увеличить продуктивность процесса культивирования по выходу морфологически типичных и жизнеспособных пастерелл с учетом гибели клеток при хранении вакцины, а также повысить качество препарата и стандартности биологических свойств вакцины. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц, включающий культивирование вакцинного штамма пастерелл в жидкой питательной среде на основе мясного гидролизата с регулированием рН на уровне 7,8 - 8,2 ед, и парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 30 - 40%, отличающийся тем, что выращивание проводят непрерывно-проточным методом с лимитированием роста пастерелл глюкозой и начальной концентрацией глюкозы в питательной среде 1 - 5 г/л при скорости разбавления 0,5 - 0,9 1/ч.