ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ПРЕПАРАТ С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ "НЕОФЕРОН" Российский патент 1999 года по МПК A61K39/395 

Описание патента на изобретение RU2129878C1

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению готовых лекарственных форм, обладающих иммуномодулирующей активностью и может быть использовано при комплексной неспецифической профилактике и лечении инфекционных заболеваний.

Известны препараты на основе тимозина α1- пептидного гормона вилочковой железы. Основным недостатком тимозина фракции 5, выделяемой из гомогенатов тимуса животных, является содержание в готовом препарате большого числа балластных полипептидов, не обладающих полезной биологической активностью, но увеличивающих иммунную нагрузку на организм.

Известен также препарат на основе фактора некроза опухолей α (ФНО), обладающий широким спектром биологической активности, однако, имеющий существенный недостаток при использовании в качестве терапевтического средства - побочные токсические эффекты.

Это обстоятельство ограничивает клиническое применение ФНО.

Сконструирована плазмида pThy 325, кодирующая субстанцию гибридного белка на основе α- тимозина и ФНО (Т-ФНО-Т) [4], отработана технология получения полупромышленных количеств хроматографически чистого белка из биомассы микроорганизмов, получение лекарственной формы препарата на основе Т-ФНО-Т. Основным недостатком указанной гибридной молекулы является отсутствие стимуляции экспрессии антигена класса II главного комплекса гистосовместимости, являющихся важным звеном распознавания инфекционных агентов клетками иммунной системы.

Известны препараты на основе интерферонов, применяемых как для усиления вакционного процесса, так и с терапевтической противовирусной и противоопухолевой целью. Основным недостатком этих препаратов является наличие у них пирогенного эффекта в связи с достаточно большими дозировками действующего начала.

Задача изобретения - разработка лекарственной формы высоко очищенного препарата, обладающего иммуномодулирующей и противовирусной активностью на основе гибридного белка Т-ФНО-Р, интерферонов альфа и гамма с синергистическим эффектом и не имеющего побочных действий.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат с иммуномодулирующими и противовирусными свойствами в лиофилизированной формуле для парентерального введения и в таблетках для приема per os, содержащий комплекс из следующих рекомбинантных цитокинов:
1) гибридного белка Т-ФНО-Т, выделенного из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, колирующая синтез белка;
2) интерферона альфа 2, выделяемого из штамма E.coli, содержащего плазмиду pTTαKm 1.4, кодирующую белок;
3) интерферона гамма, выделяемого из штамма Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTγKm2)T3γ, колирующую белок.

Для парентерального введения (форма 1) препарат готовится при следующем соотношении компонентов в 1 см3, мас.%:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Полиглюкин - 1,5 - 2,0
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06
Вода апирогенная - Остальное
В качестве солевой буферной системы используют забуференный физиологический раствор хлорида натрия.

Для перорального введения (форма 2) препарат готовится при следующем соотношении компонентов на 1 таблетку, мас.%:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,00000005
Интерферон альфа 2 - 0,00000005
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Гидроокись алюминия - 4 - 5
Крахмал - 3 - 4
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25
Глюкоза гидратная - Остальное.

Предложенный препарат получил название НЕОФЕРОН.

Пример 1. Приготовление готовой формы (N 1) препарата для парентерального введения.

Получение гибридного белка Т-ФНО-Т.

Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Escherichia coli, несущую рекомбинантную плазмиду ДНК pThy325, кодирующую синтез белка - тимозин α1- фактор некроза опухолей α-α1- тимозин (Т-ФНО-Т ).

Штамм E. coli SG 20050 трансформируют плазмидой pThy 325 следующим образом. Культуру E.coli SG 20050, полученную после хранения на косяках в полужидком агаре под вазелиновым маслом, засевают в 5 см3 LB-бульона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl при pH 7,2 и температуре 37oC. Полученной культурой засевают колбы с LB-бульоном объемом 250-500 см3 и термостатируют на качалке при температуре 37oC до оптической плотности суспензии 0,3 при длине волны 590 нм по фотоэлектроколориметру. Из полученной суспензии отбирают 100 см3 культуры и центрифугируют при 3000 g и температуре 4oC в течение 10 минут. Клеточный осадок суспендируют в 50 см3 0,1 М раствора CaCl2, охлажденного до 0oC. Приготовленные таким образом компонентные клетки в количестве 0,2 см3 смешивают с 2 мгк плазмидной ДНК pThy325 и инкубируют при температуре 0oC в течение 1 часа, затем 5 минут при температуре 42oC. Трансформированную культуру вносят в 100 см3 нагретого до температуры 37oC LB-бульона и инкубируют при указанной температуре 1-1,5 часа. Приготовленной посевной культурой свежеполученного трансформанта в количестве 100 см3 засевают ферментер вместимостью 10 дм3 в объем среды 7 дм3 (LB-бульон с ампициллином в концентрации 50 мкг/см3) и культивируют при температуре 37oC, частоте перемешивания 250 - 300 мин-1 и аэрировании среды с расходом воздуха 0,5 дм3/мин на 1 дм3 среды до выхода культуры на стационарную фазу роста. По окончании культивирования берут пробу суспензии для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в системе диск-фореза (ДСН-ПААГ).

Полученную трасформированную культуру осаждают центрифугированием (можно использовать сепарирование, микрофильтрацию) и полученный концентрат суспендируют в лизирующем буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 5 мМ Na-ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид из расчета 1 г сырой клеточной биомассы в 10 см3 буфера. Клетки в лизирующем буфере разрушают также одним из принятых методов, например, замораживанием до температуры - 70oC и оттаиванием до температуры 4oC. Лизат центрифугируют в течение 10 минут при температуре 4oC и 5000 g, затем надосадочную жидкость сливают, а осадок повторно ресуспендируют в лизирующем буфере в указанном выше соотношении - 1 г осадка на 10 см3 буфера и повторяют центрифугирование по приведенному ранее режиму. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют при соотношении 1:10 в 6 М растворе мочевины и еще раз центрифугируют. Полученная таким образом надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка Т-ФНО-Т 60-70%-ной электрофоретической чистоты. Способ последующей хроматографической очистки белка является предметом "ноу-хау". Концентрация хроматографически чистой субстанции гибридного белка Т-ФНО-Т может находиться в пределах от 300 до 1000 мкг в 1 см3 раствора.

Получение рекомбинантного белка интерферон альфа 2.

Для наработки биомассы штамма-продуцента интерферона альфа 2E.coli pTTαKm 1.4 используют 7 дм3 казеиновой среды с канамицином следующего состава, г/дм3:
Гидролизат казеина - 100
Натрий хлористый - 0,5
Аммоний хлористый - 1
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный - 6
Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 3
Глюкоза - 10
Лактоза - 5*
Магний сернокислый 7-водный - 0,25
Кальций хлористый - 0,011
Канамицин - 0,04
* - добавляется в логарифмической фазе.

Посевной материал асептически вносят в лабораторный ферментер, содержащий 6,25 дм3 стерильной среды. Выращивание в ферментере проводят при температуре 37oC, pH 7,0 поддерживают путем автоматической подтитровки 40% раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода (40 ± 10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 400 и подачи воздуха от 0,2 до 1,5 объема воздуха в мин. По достижении оптической плотности культуральной жидкости 5 о.е. асептически добавляют раствор лактозы. Ферментацию заканчивают по достижении оптической плотности 10 о. е. В конце ферментации отбирают пробу биомассы весом 1 г на анализ плазмидной ДНК и делают высев на агаризованную среду для контроля стерильности. Биомассу отделяют центрифугированием.

Для очистки интерферона альфа 2 10 г биомассы суспендируют в 20 см3 дистиллированной воды. Суспензию разливают в 2 центрифужных стакана, в которых предварительно налито по 10 см3 воды, 2 см3 лизирующего буфера и 1 см3 раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/см3. Перемешивают и проводят 2 цикла размораживания - оттаивания. Замораживание - 5 ч, оттаивание - 1 ч. Затем в каждый стакан к вязкому раствору добавляют на 10 см3 буфера для снятия вязкости. Лизаты перемешивают и инкубируют 1 ч при температуре 20oC до потери вязкости. Центрифугируют 60 мин при 18000 об/мин, супернатант сливают, а осадок используют для получения целевого продукта.

Лизирующий буфер:
ЭДТА - 0,1 М
Тритон Х-100 - 1 г/100 см3
ТрисHCl - 0,1 М
pH 7,2
Буфер для снятия вязкости:
Вода - 8 см3
Лизирующий буфер - 1 см3
1М раствор сульфата магния - 1 см3
ДНК-аза с концентрацией 1 мг/см3 - 0,25 см3
Осадок ресуспендируют, добавляя в каждый стакан по 20 см3 раствора лизирующего буфера с 8 М мочевины в соотношении 1:1. Инкубируют 30 мин при температуре 6oC и центрифугируют 60 мин при 18000 об/мин.

Осадок в каждом стакане ресуспендируют в 20 см3 буфера, содержащего Тритон Х-100 2%, 0,5 М Трис HCl, pH 7,2. Инкубируют 30 мин при 6oC и центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 20 см3 4 М мочевины pH 7,2, инкубируют 30 мин при 6oC, затем центрифугируют в тех же условиях. Повторный осадок в каждом стакане ресуспендируют в 20 см3 2% тритон Х-100, 0,5 ТрисHCl pH 7,2, центрифугируют и либо передают на очистку, либо хранят полученную суспензию телец включения при температуре минус 6 или минус 20oC до использования. Наличие альфа 2 интерферона проверяют электрофорезом в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта аффинно-очищенный аналог.

Для выделения интерферона альфа 2 из суспензии телец включения к ней добавляют порциями сухой гуанидин-гидрохлорид до конечной концентрации 8М и инкубируют при перемешивании в течение 3 ч при температуре 6oC. Полученный экстракт осветляют с помощью центрифугирования при 18000 об/мин в течение 60 мин. Для ренатурации супернатант разводят в 20 раз 0,1 М трисHCl pH 7,2 с 0,1%-ным тритоном Х-100. По данным иммуноферментного анализа и ПААГ электрофореза полученная субстанция альфа 2 интерферона содержит его в виде мономера до 70%. Общий выход при очистке составляет до 80 мг с 10 г биомассы. В субстанцию после ренатурации добавляют равный объем 0,1 М цитратного буфера pH 4,75 и доводят pH раствора раствором лимонной кислоты (раствор В) до 4,75. Полученную суспензию в количестве по белку не более 100 мг фронтально наносят на колонку с сорбентом объемом 100 см3, уравновешенную 0,1 М цитратным буфером pH 4,75 со скоростью не более 1 см3/мин. По окончании сорбции колонку промывают 5 объемами 0,1 М цитратного буфера pH 4,75 и 5 объемами 0,02 М фосфатного буфера pH 6,0. Элюцию препарата производят 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0, содержащим 0,15 М натрия хлористого под контролем абсорбциометра. Наблюдают острый пик интерферона альфа 2, который собирают для дальнейшей очистки.

Колонку К26/100 заполняют гелем Биохром H100 и уравновешивают 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0, содержащим 0,15 М натрия хлористого. Суспензия пика с предыдущей колонки (20 - 25) см3 фронтально наносят на колонку и проводят элюцию тем же буфером со скоростью 20 см3/час. Собирают мажорный белковый пик, представляющий собой субстанцию альфа 2 интерферона. Выход на этой стадии 80%, суммарный выход по процессу 65%.

0,1 М цитратный буфер:
Раствор A
Натрий лимоннокислый двузамещенный 2-водный - 26,7 ± 0,01 г
Вода - 1000 см3
Раствор B
Кислота лимонная 2- водная - 22,1 ±> 0,1 г
Вода - 1000 см3
Для получения цитратного буфера смешивают 60 см3 раствора A и 940 см3 раствора B. pH должно быть 4,75.

0,02 М фосфатный буфер:
Раствор A
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 156 г
Вода - 5000 см3
Раствор В
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2-водный - 178 г
Вода - 5000 см3
Для получения фосфатного буфера смешивают 1950 см3 раствора А и 3050 см3 раствора В.

Для приготовления фосфатного буфера с хлористым натрием в 4000 мл фосфатного буфера вносят 43,5 г натрия хлористого и раствор доводят фосфатным буфером до 5000 см3.

Полученный белок представляет собой субстанцию альфа 2 интерферона 95% хроматографической чистоты с концентрацией 400 - 500 мкг/см3.

Получение интерферона гамма.

Ампулу с исходной лиофилизированной культурой Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTγKm2)T3γ, кодирующую белок, протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, вскрывают, вносят 1 см3 L - бульона с канамицином, суспендируют и содержимое переносят в пробирку. Пробирку инкубируют в термостатированной качалке при температуре (24 ± 2)oC и частоте вращения (200 ± 20) об/мин на (16 ± 2) ч. Затем этой суспензией засевают 2 качалочные колбы с 250 см3 среды в каждой. Культивируют при тех же условиях. Показатели культуры должны удовлетворять следующими показателями:
отсутствие посторонней микрофлоры;
отсутствие спор и капсул;
колонии - округлые, слабо матовые, белого цвета, однородной структуры.

Состав среды выращивания (казеиново-дрожжевой) на 1 дм3 раствора, г:
Гидролизат казеина медицинский - 100
Гидролизат пекарских дрожжей - 5
Натрий хлористый - 0,5
Аммоний хлористый - 1
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 6
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 3
Глюкоза - 10
Магний сернокислый семиводный - 0,25
Кальций хлористый - 0,011
Канамицина сульфат - 0,02
Среду выращивания применяют для приготовления культуры штамма-продуцента в лабораторном ферментере перед лиофилизацией рабочих культур и для получения посевного материала.

Для работы с оживленной культурой готовят косяки с штаммом Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTγKm2)T3γ, кодирующую белок. Из качалостных колб после проверки однородности культуры 0,1 см3 суспензии клеток засевают на 10 чашек Петри с LB агаром и растирают шпателем. Чашки инкубируют в термостате при (37 ±0,5)oC в течение (16 ± 2) ч. Культуру размножают путем пересева на косяки с агаризованной средой, содержащей 20 мкг/см3 канамицина. Хранят на косяках не более 3 пассажей. При работе с оживленной культурой с косяков засевают 2 колбы с 250 см3 стерильной среды, инкубируют 18-20 часов в термостатируемой качалке при (200 ± 20) об/мин при температуре (24±0,5)oC. Культурой из колб засевают ферментер с (7,0 ± 0,5) дм3 стерильной казеиново-дрожжевой среды. Выращивание проводят при температуре (28 ± 0,5)oC, pH 6,9 - 6,7.

Ферментацию ведут при следующих параметрах:
1) температура среды 37,0 ± 0,5oC;
2) pH среды 6,9 ± 0,2
3) pO2 40 - 70% от насыщения
4) пеногашение на уровне датчика пенообразования с использованием силиконового пеногасителя.

В ферментере культуру выращивают до логарифмической фазы, т.е. до (10±2) ед. опт. плотности в течение (4±1) ч. В каждой стадии делают контроль на наличие посторонней микрофлоры - делают высевы на чашки Петри с агаризованной средой LB. Отделение биомассы от культуральной жидкости проводят в центрифужных стаканах вместимостью 1 дм3 центрифугированием при 10000 об/мин в течение 1 часа. Наличие гамма интерферона в биомассе определяют электрофоретически.

Для отмывки телец включения к 5 г биомассы приливают 10 см3 отмывочного раствора, ресуспендируют, затем добавляют еще 40 см3 этого раствора, перемешивают и разливают в центрифужные стаканы. Клетки осаждают в течение 15 мин при температуре (4±1)oC и частоте вращения ротора (6000 ± 500) об/мин. Затем клетки ресуспендируют в 25 см3 отмывочного раствора.

Состав отмывочного раствора:
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 90 г
Натрий хлористый - 120 г
0,5 М раствор тритона Б - 10 см3
Вода дистиллированная - До 1000 см3
Раствор 0,5 М тритона Б
Тритон Б - 37,2 г
Вода - 250 см3
В центрифужные стаканы вносят по (12±0,5) см3 раствора лизоцима, перемешивают и охлаждают при температуре минус 20oC в течение 18 - 20 часов. Суспензию размораживают, вносят по 150 см3 раствора тритона Х-100, перемешивают. Вязкость раствора снижают добавлением (0,25 ± 0,05) см3 ДНК-азы. Стаканы центрифугируют при частоте вращения ротора (8000 ± 100) об/мин, температуре (22 ± 2)oC в течение (15 ± 1) мин.

Раствор тритона Х-100:
Тритон Х-100 - 30 г
Отмывочный раствор - (620 ± 10) см3
Растворение ДНК-азы:
Флакон с лиофильно высушенной ДНК-азой (25 мг) вскрывают и пипеткой приливают (10 ± 0,1)см3 раствора магния сернокислого. После растворения осадка раствор разливают в микропробирки по 1 см3 и хранят при минус 20oC.

Раствор магния сернокислого:
Магний сернокислый семиводный - 37 г
Вода - До 100 см3
Раствор лизоцима
Лизоцим - 110 мг
Отмывочный раствор - 55 см3
К осадку в центрифужные стаканы приливают 25 см3 0,05 М раствора тритона Б, перемешивают и добавляют по (12,5 ± 0,5) см3 литического раствора, суспензию перемешивают. Затем добавляют по (150±5) см3 щелочного раствора и перемешивают. Стаканы уравновешивают и центрифугируют при скорости вращения ротора (8000 ± 100) об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливают, а осадок используют для получения субстанции гамма интерферона.

Литический раствор
0,5 моль/дм3 тритона Б - 10 см3
Вода - 100 см3
Щелочной раствор
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12 водный - 143,2 г
Натрий гидроокись - 4 г
Вода - 5 дм3
Раствор перемешивают, затем в него добавляют 20 см3 0,5 моль/дм3 раствора тритона Б и объем раствора доводят до 2 дм3.

К осадку в центрифужных стаканах приливают по (25±1) см3 щелочного раствора, перемешивают и добавляют еще (125±1) см3 щелочного раствора. Суспензию перемешивают и центрифугируют при скорости (8000±100) об/мин, температуре 22oC в течение 15 мин. Супернатант сливают, а к осадку приливают по (25±1) см3 щелочного раствора, перемешивают и повторяют центрифугирование.

К осадкам приливают (60±1) см3 мочевинного раствора тритона, перемешивают и замораживают при минус 20oC в течение 1 часа. Отделяют супернатант, содержащий гамма интерферон центрифугированием при 12000 об/мин и температуре 0oC в течение 30 мин и собирают осадок в колбы. Затем к супернатанту добавляют (60±1) см3 мочевинного раствора тритона Х-100, перемешивают и замораживают при тех же условиях в течение 4-5 часов. Размораживают, центрифугируют при тех же условиях и собирают содержащий гамма интерферон супернатант. Проводят контроль спектральных характеристик мочевинного раствора гамма интерферона.

Для концентрирования гамма интерферона хроматографический носитель КМ-52 целлюлозу уравновешивают буферным раствором, наносят образец гамма интерферона и после выхода свободного объема колонку промывают элюирующим буфером. Фракции собирают в пробирки и измеряют на спектрофотометре оптическую плотность при длинах волн λ = 280 нм и λ = 310 нм. Измерения проводят относительно контроля с элюирующим буферным раствором.

Концентрация белка в пробах определяется по формуле

где ОД280 - оптическая плотность при длине волны 280 нм
ОД310 - оптическая плотность при длине волны 310 нм
ε1 мг - коэффициент экстинкции, равный 0.1 (см3/мг)
Уравновешивающий буферный раствор
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм3 - 200 см3
Хлористый натрий 5 моль/дм3 - 40 см3
Вода - 2 дм3
pH 7,2
Элюирующий буферный раствор
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм3 - 100 см3
Хлористый натрий 5 моль/дм3 - 60 см3
Вода - 1 дм3
Следующую стадию очистки проводят методом хроматографии на КМ-52 целлюлозе. Уравновешивают колонку тем же раствором, наносят раствор гамма интерферона и элюируют градиентом буферных растворов А и В.

Элюирующий раствор А
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм3 - 50 см3
Хлористый натрий 5 моль/дм3 - 15 см3
Вода - 500 см3
pH 7,2
Элюирующий раствор В
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм3 - 50 см3
Хлористый натрий 5 моль/дм3 - 40 см3
Вода - 500 см3
pH 7,2
Фракции собирают в пробирки и проводят спектроскопический анализ. В этих фракциях отношение поглощений 280/310 должно быть не менее 2,3.

Полученная хроматографически чистая субстанция (95% чистоты) содержит 0,8 - 1,0 мг/см3 гамма интерферона.

Приготовление готовой формы препарата Неоферон для парентерального введения.

Для приготовления готовой формы препарата Неоферон для парентерального применения хроматографически чистые белки, диализованные против солевой буферной системы с pH 7,0 - 7,2 с десятикратным количеством буфера против растворов белков с содержанием целевых белков не менее 95% от общего белка и с концентрацией каждого не менее 300 ± 10 мкг/см3 смешивают с раствором полиглюкина и солевой буферной системы в следующем соотношении:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001%
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Полиглюкин - 1,5 - 2,0%
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06%
Вода апирогенная - Остальное
Рабочий раствор препарата разливают в ампулы по 0,5 - 1 см3, замораживают и лиофилизируют до остаточной влажности не выше 5%, после чего ампулы запаивают по общепринятой технологии.

Пример 2. Приготовление препарата Неоферон для перорального применения.

Готовят хроматографически чистые субстанции гибридного белка Т-ФНО-Т, интерферонов альфа 2 и гамма как описано в примере 1 с концентрациями не менее (300 ± 10) мкг/см3. Рабочие растворы белков каждый в отдельности лиофилизируют в растворе стабилизаторов, определяют биологическую активность каждого иммунологического компонента. Технология приготовления сухих субстанций гибридного белка и интерферонов является предметом "ноу-хау". Сухие субстанции белков Т-ФНО-Т, интерферонов альфа 2 и гамма смешивают с наполнителями в смесителях объемного типа при следующем соотношении, обеспечивающим расчетное содержание компонентов в расчете на одну таблетку:
Гибридный белок Т-ФНО-Т, - 0,00000005%
Интерферон альфа 2 - 0,00000005%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Гидроокись алюминия - 4 - 5%
Крахмал - 3 - 4%
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25%
Глюкоза гидратная - Остальное
Пример 3. Исследование синергизма компонентов, входящих в состав препарата Неоферон.

Готовят препарат как описано в примере 1 при следующем соотношении компонентов:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001%
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Полиглюкин - 1,5 - 2,0%
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06%
Вода апирогенная - Остальное
и оценивают его противовирусную активность в сравнении с хроматографически чистыми препаратами интерферонов.

Определение синергизма интерферонов и гибридного белка Т-ФОН-Т проводят по усилению противовирусной активности интерферона в присутствии гибридного белка Т-ФОН-Т. Для этого берется содержимое одной ампулы препарата и растворяется в 1 см3 апирогенной воды. Проводится определение противовирусной активности смеси по стандартной методике с вирусом везикулярного стоматита /8/. Антивирусная активность интерферонов в составе комплексного препарата увеличивается с 106 МЕ до 108 МЕ/см3, по сравнению с противовирусной активностью 106 МЕ/см3 аналогичных количеств чистых субстанций интерферонов в составе препаратов гамма и альфа 2 интерферонов.

Пример 4. Схема лечения собак препаратом Неоферон для парентерального и перорального применения.

При лечении начальных стадий заболеваний рекомендовалась следующая схема: в течение 3 дней по 1 дозе (0,5 см3 препарата) инъекционного Неоферона 1 раз в день для животных массой до 30 кг (исключение составляют пекинесы - не более 0,5 дозы в день, в течение 3 дней) и по 2 ампулы в день для животных массой более 30 кг. При необходимости курс инъекций повторяли с интервалом 3-5 дней. Одновременно с инъекциями животным давали таблетки Неоферона из расчета 1 табл. на 10 кг массы с целью активизировать развитие секреторного иммунного ответа и ответа макрофагального звена, представленного Пейеровыми бляшками кишечника и Купферовскими клетками печени.

При лечении животных на поздних сроках инфекции с проявлениями иммунопатологических реакций (поражение нервной ткани, поражение легких, развитие аллергических реакций) рекомендовалось до применения иммуномодуляторов применять кортикостероиды совместно со специфическими иммуноглобулинами и препаратами, подавляющими репликацию вируса (контрикал, гордокс, РНК-аза для РНК-содержащих вирусов и ДНК-аза для ДНК-содержащих вирусов), затем лечение проводилось по указанной выше схеме. После тяжелой формы вирусного заболевания в течение 1 - 3 недель назначалось применение таблетированной формы препарата для восстановления иммунного статуса животного и особенно фагоцитарного барьера печени. Появление возможных иммунопатологических реакций из-за применения больших доз иммуномодуляторов в течение длительного времени (7 дней и более) в инъекционной форме рекомендовали снимать применением гормонов кортикостероидного ряда.

По указанной схеме с использованием препарата Неоферон в инъекционной и таблитированной формах, приготовленных как показано в примерах 1 и 2, было пролечено более 170 собак с клиническими признаками чумы плотоядных, энтерита, аденовирозов. Из них 14 погибли, так как на момент начала лечения находились в терминальном состоянии. Остальные животные выздоровели без осложнений, при этом не отмечалось возникновение побочных реакций при применении препарата.

Похожие патенты RU2129878C1

название год авторы номер документа
СУХОЙ ИММУНОПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПТИЦЕВОДСТВА 1996
  • Зинченко В.Б.
  • Зинченко Е.В.
  • Панин А.Н.
  • Сандин М.М.
  • Черепанов П.А.
RU2146935C1
ПРЕПАРАТ С ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ 1995
  • Зинченко Е.В.
  • Панин А.Н.
  • Зинченко В.Б.
  • Шмелев В.А.
  • Колышкин В.М.
RU2102988C1
ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ В СУХОЙ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЕ 2002
  • Хомичев В.В.
  • Войтенко А.В.
  • Бажутин Н.Б.
  • Таргонский С.Н.
RU2236866C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА И ШТАММ ПРОДУЦЕНТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 2003
  • Черепанов П.А.
  • Михайлова Т.Г.
  • Черепанов П.П.
RU2242516C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА 2006
  • Шматченко Вадим Васильевич
  • Шматченко Наталья Анатольевна
  • Байдусь Александр Николаевич
  • Купцов Василий Николаевич
  • Ноздрин Виктор Николаевич
  • Степанов Алексей Вячеславович
RU2354702C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО 2022
  • Чумбуридзе Георгий Георгиевич
RU2809357C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА 1997
  • Пустошилова Н.М.
  • Килева Е.В.
  • Денисова Л.Я.
  • Шингарева Н.В.
  • Коробко В.Г.
  • Денисов Л.А.
  • Масычева В.И.
  • Сандахчиев Л.С.
  • Калинин Ю.Т.
RU2144958C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА 2002
  • Шмелев В.А.
  • Чумбуридзе Г.Г.
RU2214832C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО 2022
  • Чумбуридзе Георгий Георгиевич
RU2809355C1
СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ, ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ, АКТОПРОТЕКТОРНОЙ, АНТИМУТАГЕННОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2018
  • Чумбуридзе Георгий Георгиевич
RU2690677C1

Реферат патента 1999 года ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ПРЕПАРАТ С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ "НЕОФЕРОН"

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению готовых лекарственных форм, обладающих иммунoмодулиpующими и противовирусными свойствами в лиофилизированной форме для парентерального введения и в таблетках для приема per os, содержащий комплекс из следующих рекомбинантных цитокинов: 1) гибридного белка Т-ФНО-Т, выделенного из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка; 2) интерферона альфа 2, выделяемого из штамма E. coli, содержащего плазмиду pTTαKm 1.4, кодирующую белок; 3) интерферона гамма, выделяемого из штамма Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTγKm2)T3γ, кодирующую белок. Для парентерального ведения" (форма 1) препарат готовится при следующем соотношении компонентов в 1 см3; мас.%: гибридный белок Т-ФНОТ-Т - 0,0000001, ннтерферон альфа 2 0,0000001-0,0000002, интерферон гамма 0,0000001-0,0000002, полиглюкин 1,5-2,0, солевая буферная система рН 7,0-7,2 1,03-1,06, вода аспирогенная - остальное. В качестве солевой буферной системы используют забуференный физиологический раствор хлорида натрия. Для перорального применения (форма 2) препарат готовится при следующем соотношении компонентов на 1 таблетку, мас.%: гибридный белок Т-ФНО-Т 0,00000005, интерферон альфа 2--0,00000005, интерферон гамма 0,0000001-0,0000002, гидроокись алюминия 4-5, крахмал 3-4, стеарат кальция (магния) 0,2-0,25, глюкоза гидратная - остальное. Препарат обладает иммуномодулирующей активностью и может быть использован при комплексной неспецифичесной профилактики и лечении инфекционных заболеваний.

Формула изобретения RU 2 129 878 C1

Лиофилизированный продукт с иммуномодулирующими и противовирусными свойствами, отличающийся тем, что содержит гибридный белок Т-ФНО-Т, выделенный из микроорганизма, в которой введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка; интерферон альфа 2, выделяемый из штамма E.coli, содержащего плазмиду pTTαKm 1.4 кодирующую белок; интерферон гамма, выделяемый из штамма Escherichia coli МС 106, содержащего плазмиду (pTTγKm2)T3γ, кодирующую белок, стабилизирующие добавки и солевую буферную систему, при следующем соотношении компонентов в 1 см3 для парентерального применения, мас.%:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Полиглюкин - 1,5 - 2,0
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06
Вода апирогенная - Остальное
для перорального применения используется следующее соотношение компонентов на одну таблетку, мас.%%
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,00000005
Интерферон альфа 2 - 0,00000005
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Гидроокись алюминия - 4 - 5
Крахмал - 3 - 4
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25
Глюкоза гидратная - Остальное

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1999 года RU2129878C1

Способ получения иммуноглобулинового препарата 1978
  • Борисова И.В.
  • Холчев Н.В.
  • Мухина Н.А.
SU836831A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КЛАССОВ G, M И A 1992
  • Алешкин В.А.
  • Борисова И.В.
  • Новикова Л.И.
  • Сидорова Л.В.
  • Шендеров Б.А.
  • Манвелова М.А.
  • Сидоров В.С.
RU2050858C1
Малиновская В.В
и др
Иммунотерапия препаратами интерферона больных клещевым энцефалитом
// Иммунопрофилактика, иммунодиагностика и иммунокоррекция
- Омск, Омский государственный медицинский институт, 1994, с
Железобетонный фасонный камень для кладки стен 1920
  • Кутузов И.Н.
SU45A1

RU 2 129 878 C1

Авторы

Зинченко Е.В.

Зинченко В.Б.

Шмелев В.А.

Черепанов П.А.

Панин А.Н.

Груздев К.Н.

Даты

1999-05-10Публикация

1996-04-24Подача