ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ В СУХОЙ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЕ Российский патент 2004 года по МПК A61K38/21 A61K9/14 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к производству лечебно-профилактических препаратов на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме.

Проблема стабильности при хранении имеет прямое отношение к лекарственным средствам на основе рекомбинантного альфа-2-интерферона. Для повышения стабильности при хранении высокоочищенного от балластных белков субстрата культивирования альфа-2-интерферона широко используют лиофильное высушивание в присутствии наполнителя, обеспечивающего сохранение биологической активности в течение не менее одного года. В качестве наполнителя используют вещества белковой природы, биополимеры или композиции веществ, разрешенных для применения в иммунобиологических препаратах. Без наполнителя, обеспечивающего на стадии лиофилизации необходимые условия для получения объемной таблетки и служащего в качестве стабилизатора, очищенный интерферон нестабилен и в ходе хранения теряет свою биологическую активность.

Известен препарат "Реаферон", Россия [Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона а-2В-белка // Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцово, 25-29 января 1993 г., - Кольцово, 1993, - с.115-117], представляющий собой лиофильно высушенную композицию высокоочищенного рекомбинантного альфа-2 интерферона с активностью 10⁶ ME с наполнителем, в качестве которого используют человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 0,5%. Препарат используют как противовирусное средство.

Известен другой препарат на основе рекомбинантного бета-интерферона в лиофилизированной форме, в котором в качестве наполнителя и стабилизатора используют смесь ЧСА, маннитола или рафинозы (патент США №6231851, МПКА 61 К 38/21, опубл. 15.05.2001 г.).

ЧСА обеспечивает повышенную устойчивость интерферона к инактивирующим факторам высушивания и температурным воздействиям при последующем хранении препарата.

Недостаток двух вышеописанных препаратов - высокая стоимость ЧСА, который получают из крови доноров, а также требует дополнительного контроля на наличие инфицируемого материала (гепатит В и С, ВИЧ-инфекции и др.).

Известен препарат на основе рекомбинантного альфа-интерферона в лиофилизированной форме, где в качестве наполнителя и стабилизатора используют смесь стероидов, низкомолекулярного декстрана, витамина В 12 и никотиновой кислоты (патент США №5698232, МПК А 61 К 38/19, опубл. 16.12.97 г.). Препарат хранят при +4°С.

Известен другой препарат на основе рекомбинантного альфа-интерферона в лиофилизированной форме, где в качестве наполнителя и стабилизатора используют смесь дисахарида, декстрана с молекулярной массой 20000-60000 Дальтон, детергента и некоторых аминокислот (патент - США №6346274, А 61 К 38/21, опубл. 12.02.2002 г.). Препарат хранят при +4°С.

Известен препарат на основе рекомбинантного бета интерферона в лиофилизированной форме, где в качестве наполнителя и стабилизатора используют 0,5-10% раствор поливинилпирролидона (заявка ЕПВ №89245, МПК А 61 К 45/02, опубл. 21.09.83 г.). Препарат рекомендуют хранить при +4°С.

Известен препарат на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона для инъекций в лиофилизированной форме, включающий внесение полиглюкина в раствор очищенного альфа-2-интерферона, который служит наполнителем и стабилизатором при последующем высушивании [Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона а-2В-белка // Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцове, 25-29 января 1993 г., - Кольцово, 1993, - с.15-19] (препарат "Реальдирон", выпускаемый в г.Вильнюсе). Препарат хранят при +4°С.

Недостатком четырех вышеприведенных препаративных форм является то, что используемые стабилизирующие составы обеспечивают длительное хранение препаратов только при температуре +4°С.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является лиофилизированный препарат с иммуномодулирующей и противовирусной активностью "Неоферон", включающий рекомбинантный интерфером альфа-2 человека, гибридный белок Т-ФНО-Т, рекомбинантный интерферон гамма, стабилизирующую добавку, содержащую плазмозамещающий раствор полиглюкин, солевую буферную систему с рН 7,0-7,2 и воду апирогенную при следующем соотношении компонентов (мас.%): рекомбинантный интерферон альфа-2 человека 0,0000001-0,0000002; гибридный белок Т-ФНО-Т 0,0000001; рекомбинантный интерферон гамма 0,0000001-0,0000002; стабилизирующая добавка, содержащая плазмозамещающий раствор полиглюкин 1,5-2,0; солевая буферная система (рН 7,0-7,2) 1,03-1,06; вода апирогенная - остальное (патент РФ №2129878, МПК А 61 К 39/395, опубл. 10.05.99 г.). Препарат рекомендуется хранить при +4°С.

Недостатком препарата-прототипа является то, что используемый стабилизирующий состав не обеспечивает длительное хранение препарата при температуре значительно выше +4°С, например при комнатной температуре (+20±3°)С.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такого препарата на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме, хранение которого возможно при температуре значительно выше +4°С, например при комнатной температуре (+20±3°)С.

Указанный технический результат достигается тем, что препарат на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме, включающий субстанцию рекомбинантного альфа-2 интерферона человека, солевую буферную систему и стабилизирующую добавку, содержащую плазмозамещающий раствор, согласно изобретению дополнительно содержит многоатомный спирт и мочевину или ЭДТА, а в качестве плазмозамещающего раствора - полиглюкин, или реополиглюкин, или гемодез, или смесь указанных компонентов в любых соотношених при следующем начальном содержании компонентов до лиофильной сушки:

субстанция рекомбинантного альфа-2

интерферона человека активностью

10,0-20,0 млн МЕ/мл и

содержанием общего белка 0,1-0,2 мг/мл

многоатомный спирт 1,0-5,0 мг/мл

мочевина или ЭДТА 0,05-3,0 мг/мл

плазмозамещающий раствор

полиглюкин, или реополиглюкин,

или гемодез, или смесь этих

компонентов в любых соотношених) 4,0-12,0 мг/мл

солевая буферная система

с рН 7,0-7,6 11,0-14,5 мг/мл.

Наиболее оптимальным является равное соотношение полиглюкина, реополиглюкина и гемодеза (1:1:1).

Поливинилпирролидон в составе гемодеза может иметь молекулярную массу 350000 Дальтон.

В качестве многоатомного спирта препарат содержит маннит или сорбит.

В качестве солевой буферной системы препарат содержит фосфатно-солевой буфер с рН 7,0-7,6.

Полиглюкин - стерильный 6%-ный раствор (для инъекций) среднемолекулярной фракции (50000-70000 Дальтон) частично гидролизованного декстрана (полимера глюкозы) в изотоническом растворе натрия хлорида (рН 4,5-6,5). Молекулярная масса полиглюкина близка к молекулярной массе альбумина крови. Получают гидролизом нативного декстрана, синтезируемого из сахарозы при участии микроорганизмов.

Реополиглюкин - 10%-ный коллоидный раствор (для инъекций) частично гидролизованного декстрана с относительной молекулярной массой 30000-40000 (низкомолекулярная фракция декстрана) с добавлением изотонического раствора натрия хлорида (рН 4,0-6,5).

Гемодез - водно-солевой раствор (для инъекций), содержащий 6% низкомолекулярного поливинилпирролидона (относительная молекулярная масса 10000-15000 Дальтон) и ионы натрия, калия, кальция, магния и хлора (рН 5,2-7,0).

В составе гемодеза может быть использован поливинилпирролидон с относительной молекулярной массой 350000 Дальтон).

Полиглюкин, реополиглюкин и гемодез оказывают стабилизирующее (защитное) действие на молекулу интерферона в процессе сушки препарата.

Смесь плазмозамещающих растворов полиглюкина, реополиглюкина и гемодеза в различных соотношениях, в том числе наиболее оптимальном 1:1:1, обеспечивает получение стабилизирующей добавки с широким диапазоном относительной молекулярной массы от 10000-350000 Дальтон, что повышает ее защитные (стабилизирующие) свойства, как матрицы по сравнению с отдельными компонентами этой смеси.

Сорбит и маннит являются многоатомными спиртами и относятся к группе сахаров. Применяется в медицине в инъекционной форме в качестве диуретиков. Оказывают стабилизирующее действие на молекулу интерферона (защита водородных связей) в процессе лиофильной сушки (сальватации ионов при удалении растворителя).

Мочевина (карбамид или амид угольной кислоты) применяется в медицине в инъекционной форме в качестве диуретика и как противоотечное и гипотензивное средство. В заявляемом препарате выполняет функции хелатирующего агента.

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) обладает антиоксидантными свойствами, консервант белков и хелатирующий агент, образующий комплексонаты с металлами, что оказывает стабилизирующее действие на белки, в частности интерферон.

Солевая буферная система представляет собой фосфатно-солевой буфер, который служит для стабильного сохранения рН препарата равным 7,0-7,6.

Сравнение заявляемого способа получения рекомбинантного интерферона альфа-2 с известными аналогами показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новые, не известные ранее свойства, а именно обеспечивают стабильное хранение препарата в лиофилизированной форме при температуре (+20±3°)С в течение 12 и более месяцев.

В связи с изложенным техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Ниже в таблице 1 приведены примеры 1-8 составов заявляемого препарата.

Пример 9. Получение препарата рекомбинантного альфа-2 интерферона

Для приготовления препарата используют полуфабрикат (субстанцию) альфа-2 интерферона рекомбинантного по ВФС 42-227ВС-89, представляющего собой стерильный раствор рН 7,0-7,6, с концентрацией белка 0,1-0,2 мг/мл и специфической активностью (1-2) 10⁷ МЕ/мл. Данный полуфабрикат смешивают с компонентами стабилизирующей добавки (примеры 1-8, табл.1) и солевой буферной системой. Солевая буферная система содержит (мг/мл):

- хлористый натрий (NaCl) 8,0-11,0

- однозамещенный фосфат натрия (Na₂HPO₄ 12H₂O) 2,7-3,0

- двузамещенный фосфат натрия (NaH₂PO₄ 2H₂O) 0,3-0,5

Полученную смесь разливают по 3,0 или 5,0 мл в ампулы (пенфлаконы), замораживают в холодильной камере при температуре не выше -30°С, после чего лиофилизируют. Время высушивания на установке типа TG-50 составляет 48 час при остаточном давлении в камере лиофилизатора 10-50 мм рт.ст. и температуре подогрева полок не выше 20°С.

Активность всех препаратов (примеры 1-8) после сушки составляет 6,5·10⁶ МЕ/мл.

Пример 10. Определение активности препаратов альфа-2 интерферона в процессе хранения

Противовирусную активность альфа-2 интерферона определяют (в соответствии с ФСП 42-0241118401) на культуре клеток Л-68 против вируса везикулярного стоматита (ВВС). ВВС предварительно пассируют на куринных эмбрионах по ТУ 42-14-99-77, проводят не менее 3-х пассажей при заражающей дозе 100-1000 ТЦД50/0.1 мл. Инфекционная активность материала должна составлять 1·10⁶-1·10⁷ ТЦД50/мл. Монослой клеток Л-68 выращивают на матраце вместимостью 1000 мл в присутствии ростовой среды (среда Игла MEM с двойным набором инградиентов - 90% по ФС 42-7ВС-90, сыворотка плодов коровы по ФС 42-7ВС-90-10%) с антибиотиками (канамицина 100 000 Ед/мл, гентамицина 16 Ед/мл), после чего клетки снимают со стекла, суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают их количество в счетной камере Горяева. После этого клеточную взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс/мл. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл клеточной взвеси и через 2-3 суток инкубации при 37°С получают монослойную культуру. Содержания активного альфа-2 интерферона определяют в готовом, сухом, препарате, для чего его растворяют, используя воду для инъекций, до исходного объема. Затем готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) испытуемого препарата и отраслевого стандартного образца (ОСО) активности в среде 199 или Игла с 2% сыворотки плодов коровы и антибиотиками (пенициллин, стрептомицин). На каждое разведение используют не менее 4-х лунок с культурой клеток. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл каждого разведения интерферона, 16 лунок оставляют для контроля инфицирующей дозы и 4 лунки для контроля клеточной культуры. Инкубацию проводят в течение суток при 37°С в атмосфере с 5,0±0,5% СО₂, после чего в каждую лунку, включая контрольные, вносят дозу ВВС, равную 100 ТЦД50 в 0,1 мл. После внесения индикаторного вируса культуру клеток инкубируют в течение 2-3 суток. Учет проводят, если нет признаков дегенирации в контрольной культуре. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса. Пересчет активности в ME осуществляют по формуле:

Данные по противовирусной активности заявляемых препаратов альфа-2 интерферона приведены в таблице 2 в процессе хранения при температуре +20±3°С в течение от 1 до 12 месяцев.

Кроме того, активность интерферона (в % к исходному) дополнительно исследуют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ). Метод основан на разделении веществ, в частности белков, имеющих разный размер молекул. Раствор смеси белков, содержащих белок интерферона, под действием внешних сил, например силы тяжести или разности давления, протекает через колонку, заполненную гидратированным полимерным материалом (сорбентом), изготовленным в виде гранул определенных размеров. Такая колонка позволяет рассортировать белковые молекулы по размерам. В настоящей методике применяется колонка размером (2×64) мм, в качестве сорбента используют нуклеосил с размером частиц 5 мкм и размером пор 100 ангстрем, а в качестве элюента - градиент ацитонитрила в 0,1% тетрафторуглероде.

Активный белок интерферона отличается размером (конформацией) от инактивированного (денатурированного) белка интерферона и имеет более высокую скорость прохождения через колонку, что отображается на хромотограмме в виде пиков, смещенных относительно друг друга. При сравнении пиков активного и денатурированного белков интерферона на хроматограмме определяют активность интерферона (в % к исходному). Более подробно используемая методика ВЖХ описана в: (Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии под редакцией А.Хенмен, Ф.Лотшпайх, В.Вельтер. - М.: Мир, 1988, с.216, 223-230).

Данные по определению активности заявляемых препаратов альфа-2 интерферона методом ВЖХ приведены в таблице 2 в процессе хранения при температуре (+20±3)°С в течение от 1 до 12 месяцев.

Анализ таблицы 2 показывает, что заявляемый состав препарата обеспечивает стабильное сохранение (при незначительном падении) активности рекомбинантного альфа-2 интерферона после 12 месяцев хранения при температуре (+20±3)°С, что не хуже известного аналога рекомбинантного интерферона альфа-2 с человеческим сывороточным альбумином, используемым в качестве стабилизатора и наполнителя, хранение которого обеспечивается только при температуре +4°С. Однако ЧСА, как указывалось выше, имеет высокую стоимость, который получают из крови доноров, а также требует дополнительного контроля на наличие инфицируемого материала (гепатит В и С, ВИЧ-инфекции и др.).

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к производству лечебно-профилактических препаратов на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме. Препарат включает субстанцию рекомбинантного альфа-2 интерферона человека, солевую буферную систему и стабилизирующую добавку, содержащую плазмозамещающий раствор, многоатомный спирт и мочевину или ЭДТА. В качестве плазмозамещающего раствора препарат содержит полиглюкин, или реополиглюкин, или гемодез, или смесь указанных компонентов в соотношении 1:1:1. Технический результат - создание препарата на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме, хранение которого возможно при температуре значительно выше 4°С, например при комнатной температуре (20±3°)С. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Препарат на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека для инъекций в сухой лиофилизированной форме, включающий субстанцию рекомбинантного альфа-2 интерферона человека, солевую буферную систему, стабилизирующую добавку, содержащую плазмозамещающий раствор, и воду апирогенную, отличающийся тем, что препарат дополнительно содержит многоатомный спирт и мочевину или ЭДТА, а в качестве плазмозамещающего раствора - полиглюкин, или реополиглюкин, или гемодез на основе поливинилпирролидона, или смесь указанных компонентов в соотношении 1:1:1 при следующем начальном содержании компонентов до лиофильной сушки:

Субстанция рекомбинантного альфа-2

интерферона человека с активностью

10,0-20,0 млн МЕ/мл и содержанием

общего белка 0,1-0,2 мг/мл

Многоатомный спирт 1,0-5,0 мг/мл

Мочевина или ЭДТА 0,05-3,0 мг/мл

Плазмозамещающий раствор:

полиглюкин, или реополиглюкин,

или гемодез на основе поливинил-

пирролидона, или смесь этих

компонентов в соотношении 1:1:1 4,0-12,0 мг/мл

Солевая буферная система

с рН 7,0-7,6 11,0-14,5 мг/мл

Вода апирогенная Остальное до 1 мл