СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 A61K39/205 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу определения антирабических вируснейтрализующих антител методом ингибиции фокусов флуоресценции и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и в ветеринарных лабораториях.

Известны, более 15 методов in vivo и in vitro для определения антирабических вируснейтрализующих антител (Blancou J.J., Sureau P., 1985; Ботвинкин А. Д., 1988; Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., 1991; Сологуб Т.В., Никишин И.В., 1992; и др.). Наиболее распространенными до сих пор являются различные модификации реакции нейтрализации in vivo - на мышах, разработанной Webster & Dawson (1935 г.). Однако, несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного теста, он имеет некоторые недостатки: использование инфекционного вируса "CVS", проведение опыта в виварных помещениях в течение 15-21 суток, относительно дорогая стоимость животных. В связи с этим комитет экспертов ВОЗ по бешенству с 1973 г., в своих докладах подчеркивает важность разработки тестов in vitro (СТД ВОЗ: 523, 709, 824). Для относительной оценки уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке животных применяется иммуносорбентный метод - ELISA (Guillemin P., Tixier G. (1981), Nicholson Karl G. (1982), Smith J. S. (1984), Karamany R.M. (1988), Ботвинкин А.Д. (1988), Lyng Jorn; Bentzon M. Weis; Fitzgerald E.A. (1989), Сазанова Э.Я. (1991)). Этот тест может выполняться в практических условиях, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Однако, кроме вируснейтрализующих антител, этот метод определяет также различные антитела других типов, при этом отсутствует их корреляция с тестом нейтрализации in vivo на мышах. Прототипом настоящего изобретения являются методы ингибиции фокусов флуоресценции, выполненные на различных культурах клеток с разными штаммами вируса бешенства J. G. Debbie et al., (1972) - использовали штамм ERA в культуре клеток ВНК-21; Smith J. S., Yager P. A., Baer G.M., (1973) - использовали штамм "CVS-11", культивируемый в культуре клеток BHK-21/S13; Louie R. E. et al., (1975), Zalan E., Wilson С., Pukitis D., (1979) - штамм "CVS-27" в ВНК. Аналогичные штаммы и культуры клеток применяли при постановке реакции Seroka D. Labunska E. (1981); Kurz J. et al. (1986); Lyng J., Bentzon M. , Fitzgerald E.A. (1989) и др. Zavadova J., Svrcek S., Madar M., Durove A. (1996) использовали штамм Внуково 32/107, культивируемый в ВНК-21/с13. Принцип постановки реакций у перечисленных авторов идентичен и заключается в том, что разведения образцов сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37^oC в течение 90 минут, после этого реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37^oC, затем культуру клеток фиксируют, наносят антирабические иммуноглобулины конъюгированные с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и проводят учет реакции. Однако авторы оценивают полученные результаты как не полностью коррелирующие с результатами реакции нейтрализации на мышах. В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет. Целью предполагаемого изобретения является разработка способа определения антирабических вируснейтрализующих антител in vitro, имеющего корреляцию с результатами титрования на белых мышах.

Поставленная цель достигается тем, что используют вакцинный штамм ТС-80, адаптированный к культуре клеток почки сайги (ПС), на которой проводят инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 72 часов, с последующим определением титра вируснейтрализующих антител по ингибиции фокусов флуоресценции
Примеры конкретного выполнения
Пример 1
Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, подвергали инактивации в условиях водяной бани при 56^oC в течение 30 мин. Затем готовили двухкратные разведения сывороток на среде Игла MEM в объеме 100 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равными объемами культурального вируса бешенства шт. ТС-80, содержащим 100 - 1000 БОЕ₅₀. Приготовленную таким образом смесь вирус-сыворотка инкубировали в течение 90 мин при 37^oC в CO₂-инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа и вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную на полистироловых пластинах, предварительно удалив из лунок культуральную среду.

Пластины помещали в CO₂-инкубатор на 72 часа. Контролями служили: лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) сывороткой и отрицательной (нормальной), а также интакной культурой клеток.

По окончании срока инкубации монослой клеток подвергали фиксации 12,5% раствором формалина в течение 15 минут при -4^oC.

После фиксации панели отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с 0,05% содержанием Твина-20 и наносили конъюгат антирабических иммуноглобулинов с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Пластины с ФИТЦ-конъюгатом инкубировали в течение 30 мин, после чего панели трижды подвергались отмывке от несвязавшегося конъюгата в ЗФР с 0,05% содержанием Твина-20.

Тест-препараты просматривали на инвертированном люминесцентном микроскопе Olympus IMT-2. Отсутствие флуоресцирующих фокусов (при условии наличия последних в препаратах с контролем вируса и нормальной сывороткой) указывает на наличие в тест-материале специфических антирабических вируснейтрализующих антител. Титром антител в испытуемом материале является предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление флуоресцирующих фокусов, т.е. нейтрализация вируса.

Пример 2
Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично методике, описанной выше. По истечении срока инкубирования образцы сывороток вносили в лунки полистироловых панелей. После этого в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 500 тыс. клеток/см³ с расчетом по 50 тыс. клеток на лунку, после чего пластины помещают в CO₂-инкубатор на 72 часа. Последующие этапы реакции проводились согласно предыдущей методике. При проведении работы результаты обоих примеров были аналогичны.

Результаты исследования сыворотки крови реакцией нейтрализации на мышах и предлагаемым нами способом в культуре клеток ПС были идентичны. В таблице 1 приведены результаты, полученные в комиссионном опыте при определении вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, лошадей и собак.

Тест ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток ПС прост в исполнении, безопасен в виду использования вакцинного штамма ТС-80, обладает большей производительностью, экономически эффективен и может быть использован при определении напряженности иммунитета у вакцинированных животных.

Полученные результаты исследования сывороток крови показывают, что предлагаемый способ позволяет определять титр вируснейтрализующих антител in vitro (в культуре клеток ПС), соответствующий результатам реакции нейтрализации на мышах. Данный способ прост в исполнении, экспрессен, безопасен, высокочувствителен и в силу полного соответствия с результатами реакции нейтрализации in vivo может полностью заменить тест нейтрализации на мышах.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, касается определения антирабических вируснейтрализующих антител методом ингибиции фокусов флуоресценции. Исследуемую сыворотку смешивают с равным объемом аттенуированного штамма вируса бешенства ТС-80. Инкубируют в течение 90 мин при 37^oС. После этого реакционную смесь вносят в перевиваемую культуру клеток почки сайги. Затем культуру клеток фиксируют и наносят антирабические иммуноглобулины, меченные ФИТЦ. Реакцию оценивают по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток. Технический результат изобретения заключается в разработке безопасного, чувствительного, быстрого и экономически выгодного способа определения антирабических вируснейтрализующих антител in vitro, имеющего корреляцию с результатами титрования на белых мышах. 1 табл.

Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител, включающий взаимодействие компонентов реакционной смеси вируса со специфической сывороткой, оцениваемое по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток, отличающийся тем, что используют аттенуированный штамм ТС-80 вируса бешенства, адаптированный к высокочувствительной к этому штамму культуре перевиваемых клеток почки сайги.