СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/205 A61K39/42 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностической гипериммунной антирабической сыворотки крови овец, и может быть использовано в научных учреждениях, предприятиях биологической промышленности и производственных лабораториях.

В настоящее время лабораторная диагностика бешенства базируется на серологических методах, достоверность которых зависит от качества ряда используемых реагентов и, в первую очередь, от активности и специфичности иммуноглобулинов [Laboratory techniques in rabies.- 1996,-450 с.].

В практике получения антирабических сывороток крови ряд исследователей использовали различные виды гетерологичных и гомологичных животных (морских свинок, кроликов, собак, овец, ослов, крупного рогатого скота, лошадей).

Кузнецова С. В. (1975), Бучнев К.Н. (1985) иммунизировали различных животных гомологичными и гетерологичными антигенами вируса бешенства, инактивированными 0,5% фенолом, материал вводили в возрастающих концентрация подкожно с интервалом между введениями 2-3 дня [Кузнецова С.В., Передереев Н. И. , Кузнецов П.П., Простяков А.П., Игнатьева B.C. Метод получения антирабической сыворотки // Тр. ВГНКИ. - 1975. - XXII, - с. 51-54; Бучнев К.Н., Квасов И.Л., Турсункулов Ш.Ж. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей, привитых рабическими вирус-антигенами // Вестник с/х науки Казахстана. - 1985. - 2, - c.71-75].

Fuenzalida Е. и Palacios R. (1964), а позже Селимов М.А. (1978) для приготовления гипериммунной сыворотки использовали лошадей, которых подкожно иммунизировали вначале вирусом бешенства инактивированным фенолом, а затем вирулентным вирусом с интервалом 7 дней, но на заключительном этапе проводили сочетанное введение антигена подкожно, внутримышечно и внутрикожно [Fuenzalida Е., Palacios R. Production antirabic serum in horse // Bull. Wld Halth Org. - 1964. - 30, - p.437; Селимов М.А., Гордиенко Е.Г., Рачинская М. С. Антирабический гамма-глобулин из сыворотки лошадей // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - 1978, - с. 308-315].

Бусыгин К.Ф. (1986) и Турсункулов Ш.Ж. (1990) проводили гипериммунизацию лошадей, крупного рогатого скота и овец инактивированным, а затем вирулентным вирусом бешенства с интервалами в 7 дней. Авторами показано, что оптимальным при иммунизации является использование антигенов гомологичных виду продуцентов, которые обладают более выраженными иммуногенными свойствами по сравнению с гетерологичными [Бусыгин К.Ф. Флуоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови баранов // Болезни животных. - 1986. - 89-91; Турсункулов Ш. Ж. Усовершенствование схем иммунизации лошадей, волов и овец-продуцентов гипериммунной антирабической сывороткой // Автореф. дис. канд. вет. наук. - 1990, - 25 с.].

Прототипом настоящего изобретения является способ получения антирабических сывороток, предложенный Luekrajang Т., (1996). Принцип способа заключается в подкожном введении инактивированного антигена в одну точку с интервалом 7 дней (при первичном введении с полным адъювантом Фрейнда) на протяжении 105 дней [Luekrajang Т., Wangsar. Т. и Phanuphak P. Production of antirabies serum of equine origin // Laboratory techniques in rabies. - 1996, - p. 401-403].

Таким образом, все известные способы получения антирабической сыворотки заключались во введении вируса под кожу животных (только на заключительных этапах использовали иной способ иммунизации) с 1-7 дневными интервалами, т. е. не учитывали динамику формирования антител и интервалы между инъекциями антигена.

Хотя достоверно известно, что клон иммунологической памяти, способный реагировать по вторичному типу, формируется только к 30 дню после первичного введения рабического антигена, а оптимальным интервалом между последующими инъекциями является период не менее 14 дней [Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций // Дисс. докт. мед. наук. - М., - 1993, - 80 с.].

Кроме этого, немаловажное значение имеет способ аппликации антигена, поскольку показана зависимость формирования иммунитета от обеспечения контакта рабического антигена с обширной сетью нервных рецепторов. Установлено, что наиболее выраженный иммунитет наблюдается при иммунизации животных внутрикожно и в меньшей степени иммуногенная потенция проявляется при аппликации внутримышечно и еще меньше - подкожно [Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций // Дисс. докт. мед. наук. - М. , - 1993, - 80 с; Иванов B.C., Самуйленко А.Я., Титеричев В.И., Иванов И.В. Проявление иммуногенной потенции антирабической вакцины из штамма Щелково-51 в зависимости от места ее введения // Тезисы конф. - Щелково. - 2000, - с.33-36].

Так, при внутрикожной иммунизации у животных вырабатывались антирабические антитела в титре 1:800, при внутримышечном введении - 1:200-400, а при подкожном 1:100 [Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства // Автореф. дисс. на соис. уч. ст. к. вет. н. - Покров. - 1998, 24 с.].

Поэтому с учетом вышеописанного и в отличие от прототипов для получения высокоактивной антирабической сыворотки крови овец необходимо использование грундиммунизации с последующей комбинированной иммунизацией (внутрикожной и внутримышечной) овец гомологичным сорбированным и эмульгированным антигенами и введением антигена с высокой множественностью инъецирования.

В связи с этим нами разработан способ гипериммунизации животных при внутрикожном или внутримышечном введении антигена. Целью предлагаемого изобретения является разработка эффективного и безопасного способа получения гипериммунной антирабической сыворотки, обладающей высокой вируснейтрализующей и преципитирующей активностью.

Поставленная цель достигается тем, что при получении сывороток крови овец животных иммунизируют внутрикожным и внутримышечным способами инактивированным вирусом бешенства, референс-штаммом CVS, с высокой множественностью инъецирования (3-42 точек), с сочетанным использованием адъювантов и соблюдением интервалов иммунизации (14 дней).

В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нами не обнаружено.

Примеры конкретного выполнения
Для иммунизации применяли гомологичный антиген вируса бешенства, представляющий собой 5%-ную суспензию мозга овец, инфицированных вирусом бешенства, референс-штамм CVS, инактивированную β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2 ч при 37^oС).

Антиген, предназначенный для внутрикожного введения, эмульгировали в равных пропорциях с адъювантом Фрейнда (первоначально в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), в последующем в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ)). Антиген для внутримышечного введения сорбировали на 0,3% гидроокиси алюминия в течение 18 ч при 4^oС. Схема иммунизации представлена в таблице 1.

После окончания иммунизации отбирали сыворотки крови и определяли уровень вируснейтрализующих и преципитирующих антител в тесте ингибиции фокусов флуоресценции (ТИФФ) и реакции диффузионной преципитации (РДП).

С целью сравнительных исследований проведена иммунизация овец аналогично подготовленным антигеном (гомологичный, инактивированный, сорбированный), но традиционным способом - подкожно. Результаты сравнительного тестирования активности полученных гипериммунных сывороток представлены в табл. 2.

Из данных таблицы видно, что титр сывороток крови овец, полученных предлагаемым способом, составлял в ТИФФ 1:10240-20480, в РДП 1:16-32.

Следовательно, предлагаемым способом гипериммунизации овец можно получить высокоактивные антирабические сыворотки крови, пригодные для разработки высокочувствительных и специфичных средств диагностики бешенства.

Предлагаемый способ безопасен и может быть промышленно применен в научно-исследовательских институтах и производственных лабораториях.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Способ осуществляется путем 5-кратной иммунизации овец инактивированным вирусом бешенства. Иммунизацию проводят в 3-42 точки животного с интервалом 14 дней. Способ позволяет получать сыворотки крови овец с титрами антител в тесте ингибиции фокусов флюоресценции 1: 10240 - 20480, а в реакции диффузной преципитации - 1:16 - 32. Способ позволяет эффективно и безопасно получать гипериммунные антирабические сыворотки с высокой вируснейтрализующей и преципитирующей активностью. 2 табл.

Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки крови овец, включающий иммунизацию овец инактивированным антигеном вируса бешенства и выделение гипериммунных антирабических сывороток, отличающийся тем, что иммунизацию овец проводят 5-кратно с интервалом 14 дней, используя внутрикожное и внутримышечное введение антигена вируса бешенства с адъювантами (адъюванты Фрейнда и гидроокись алюминия соответственно) в 3-4-2 точки животного, а выделенные сыворотки имеют титр антител в тесте ингибиции фокусов флюоресценции 1: 10240 - 20480, а в реакции диффузной преципитации - 1: 16 - 32.