АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ VIRUS PESTIS CARNIVORUM Российский патент 1998 года по МПК C12N7/00 A61K39/175 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к аттенуированным вирусам чумы плотоядных, и может быть использовано в научных и производственных лабораториях и на предприятиях биологической промышленности при изготовлении препаратов для диагностики и специфической профилактики заболевания пушных зверей и собак, вызванного вирусом чумы плотоядных.

Известны вакцинные штаммы Рокборн и 668-КФ, а также модифицированные авирулентные варианты штаммов Onderstepoort, Wisconsin, Snyder Hill и других, адаптированные к выращиванию в первичных и перевиваемых культурах клеток животного и птичьего происхождения и которое используются при получении профилактических препаратов против чум плотоядных (патенты ФРГ N1138888, кл. 30h6, 1962; патент США, кл. 424-89, N2965544, 1960; N3155589, 1964; N3836626, 1974; N4351827, 1982; N5000951, 1990; авт. св. СССР, кл. C 12 N 7/08, N527072, 1977; кл. A 61 K 39/12, N1287592, 1984; патент СРР, кл. A 61 K 39/175 N82518, 1983).

Известен также широко применяемый в нашей стране при производстве моно-, би- и поливалентных культуральных вакцин для защиты пушных зверей и собак штамм ЭПМ вируса чум плотоядных (ЧП), адаптированный к выращиванию в культуре клеток эмбриона японской перепелки (патент США, кл. 435-237 N4224412, 1980; патент РФ, кл. A 61 K 39/295, N 2030917, 1995).

Штамм ЭПМ характеризуется свойствами вакцинного штамма: ареактогенен, иммуногенен, свободен от вирусов - контаминантов, патогенных для пушных зверей и собак (в том числе от вирусов лейкозносаркоматозного комплекса), обладает антигенной и инфекционной активностью (по цитопатогенному действию ЦПД в культуре клеток перепелиных эмбрионов и по бляшкам на хорионаллантоисной мембране ХАО куриных эмбрионов), неконтагиозен, стабилен при хранении. Одна прививочная доза вакцины из штамма ЭПМ содержит: для собак - от 630 до 6300 ТЦД 50, для норок, соболей и хорьков - от 120 до 1200 ТЦД 50, для лисиц и песцов - от 240 до 2400 ТЦД 50 вируса.

Основным недостатком штамма ЭПМ (прототипа) является использование при его поддержании и культивировании эмбрионов японской перепелки (ЭП), которые несвободны от посторонних микроорганизмов (агентов вирусной природы, микоплазм), что требует создания специализированных, постоянно контролируемых птицеферм со здоровым поголовьем и чрезвычайно повышает расходы на производство и контроль контаминированности перепелиного стада, яиц и биопрепаратов (Пшеничнов В. А. , Семенов Б.Ф, // Труды Перм. мед. ин-та.-1974, т. 124, с. 11-16).

Второй недостаток прототипа состоит в нестандартности применяемого клеточного субстрата, а следовательно, в вариабельности результатов научно-исследовательских и производственных работ на ЭП, что обусловлено невозможностью получить из гомогена клеток эмбриона больших партий однородных по своим характеристикам (по чувствительности затрат на контроль пригодности каждого источника ткани.

К другим недостаткам штамма ЭПМ следует отнести то, что при культивировании он дает максимальное накопление специфического антигена и биологической активности до 2000 - 20000 ТЦД 50/см³ только на 11 - 14 сут после инокуляции в культуру клеток, что значительно удлиняет технологический процесс наработки вируссодержащего материала и изготовления биопрепаратов.

Целью изобретения является аттенуированный, безвредный и высокоиммуногенный штамм вируса ЧП для изготовления высокоактивных, стандартных и дешевых диагностических и вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигается адаптацией штамма ЭПМ посредством серии перемежающих пассажей к сублинии перевиваемых клеток из почки африканской зеленой мартышки, полученной в ВНИИВВиМ из исходной культуры CV-1, с последующим клонированием методом предельных разведений и поддерживанием в указанной клеточной системе.

Новый аттенуированный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства.

Штамм обладает морфологическими свойствами, характерными для вируса ЧП рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae.

Культуральные свойства.

Штамм размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с развитием ярко выраженного ЦПД в виде симпластов и последующей деструкцией клеток. Титр вируса в указанной культуре достигает до 5625 - 31620 ТЦП 50/см³. Без адаптации вирус размножается в культуре клеток из тканей куриных и перепелиных эмбрионов, вызывая специфическое ЦПД и накаливаясь в титрах до 1000-10000 ТЦД 50/см³.

Способ выращивания.

Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток сублинии CV-1 в стационарных и роллерных культурах. В оптимальных условиях максимум биологической активности достигается через 36 - 52 ч. В качестве питательной среды используют среду Игла-МЕМ с 4,5 - 5 об.% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), pH 7,2 - 7,4.

Генетические маркеры.

Размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с проявлением специфического ЦПД.

Антигенные свойства.

Вызывает образование вируснейтрализующих антител.

Гемагглютинирующие свойства. Не обладает.

Бляшкообразующая способность. Не регулярно образует бляшки на ХАО куриных эмбрионов.

Патогенность для человека. Непатогенен.

Вирулентность для восприимчивых животных. Невирулентен.

Безвредность для лабораторных животных. Безвреден.

Контагиозность. Неконтагиозен.

Реверсия в вирулентное состояние. Нереверсибелен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Неконтаминирован.

Иммуногенные свойства.

Индуцирует формирование иммунитета против ЧП у пушных зверей (норок, тхорзофреток, песцов, лис, енотов) и собак. У вакцинированных животных выявляются вируснейтрализующие антитела к вирусу ЧП в титрах 1:8-1:32 и выше.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков.

В течение 10 последовательных пассажей в культуре клеток сублинии CV-1.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40^oC и "освежают" пассированием в культуре клеток сублинии CV-1 один раз в 5 лет.

Предлагаемый штамм отличается от известного штамма ЭПМ тем, что выращивается в перевиваемой линии клеток и обладает в ней высокой репродуцирующей способностью. Небольшой период культивирования (до 2 сут), достаточно высокая биологическая активность (до 31620 ТЦД 50/см³), безвредность, антигенная и иммуногенная активность нового штамма гарантируются условиями адаптации и клонирования, при которых достигается стабильность его аттенуированных свойств, генетических и иммунобиологических признаков. Предлагаемый штамм легко культивируется на недефицитной питательной среде Игла-МЕМ с использованием сыворотки крови КРС, не теряет своих полезных свойств после низкотемпературного хранения и "освежения".

Новый штамм адаптирован к выращиванию в неонкогенной, стабильной, с высокой пролиферативной активностью перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1, что исключает необходимость использования дорогостоящей, нестандартной и небезопасной первичной культуры ЭП и приводит к уменьшению экономических затрат на получение вируссодержащего культурального материала, а следовательно, культуральной вирусвакцины и диагностических препаратов. Высокая стандартность вируссодержащего материала обусловлена способом поддерживания нового штамма, основанном на системе посевных серий вируса и клеток, а также на криобанке рабочих клеток, охарактеризованных по стабильности морфологических, ростовых и кариологических показателей, на отсутствие туморогенности, контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами (Каталог клеточной коллекции ВНИИВВиМ, номер 43.2).

Предлагаемый аттенурованный штамм вируса ЧП был обозначен как штамм "ВНИИВВиМ-88" и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером "ВНИИВВиМ-88 Деп" (справка о депонировании прилагается).

Для иллюстрации преимуществ настоящего изобретения ниже приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Получение посевного вируса.

Для этой цели используют штамм "ВНИИВВиМ-88" 4-го пассажа с титром 10000 ТЦД 50/см³, хранившийся в лиофилизированном состоянии в ампулах по 1 см³ при минус 70^oC, и монослойную культуру клеток сублинии CV-1 в матрасах, поддерживаемую серийным пассированием общеизвестным безциентрифужным способом с коэффициентом пересева 1: 3. В качестве ростовой среды применяют среду Игла-МЕМ с 9-10 об.% сыворотки крови КРС.

Двухсуточный монослой клеток, выращенный в матрасах емкостью 1,5 дм³, инфицируют штаммом "ВНИИВВиМ-88" из расчета 0,0005 - 0,001 ТЦП 50/клетку, предварительно слив из них ростовую среду. Контакт вируса с клетками проводят в течение 30 - 40 мин при 36,5-37,5^oC, затем в каждый матрас вносят по 150 см³ поддерживающей среды Игла-МЕМ с 4,5-5 об.% сыворотки крови КРС.

Культивирование вируса проводят при 36,5-37,5^oC в течение 36-52 ч. При проявлении специфического ЦПД у 50% клеток вирус сливают из матрасов, предварительно отобрав из них пробы для контроля на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и титрования по ЦПД в культуре сублинии CV-1.

Стерильный вирус фасуют во флаконы и хранят до использования при температуре от минус 70 до минус 50^oC. Посевной вирус используют для получения вирусного сырья при производстве культуральной вирусвакцины и вирусспецифического антигена (пример 2). Всего в нашем опыте с 4-х матрасов получено 600 см³ посевного вируса 5-го пассажа с титром 31620 ТЦД 50/см³.

Чтобы получить достаточное количество стандартного и дешевого вирусного сырья, проводят до 10-ти последовательных серийных пассажей вируса, как описано выше. Репродукция вируса при пассировании сопровождается развитием ЦПД и высоким уровнем накопления (до 31620 ТЦД 50/см³) в те же сроки. В примерах 3 - 7 штамм "ВНИИВВиМ-88" различных пассажей охарактеризован по таким основным показателям, как безвредность для лабораторных животных и пушных зверей, ареактогенность, антигенная и иммунногенная активность.

Пример 2. Получение вирусспецифического антигена.

Культивирование вируса проводят в монослойной культуре клеток сублинии CV-1 в роллерных сосудах или матрасах соответственно емкостью 3 или 1,5 дм³ при условиях, указанных в примере 1.

При проявлении ЦПД в виде симпластов в 50-70% монослоя клетки отделяют от стекла в культуральную жидкость при помощи кисточки или встряхиванием сосудов. Клетки осаждают центрифугированием при 2000-2500 g в течение 15-20 мин и ресуспендируют и физиологическом растворе из расчета 1-2 см³ на 100 см³ исходной культуральной жидкости.

Суспензию клеток однократно замораживают и оттаивают, вновь центрифугируют и надосадок используют в реакции диффузной преципитации в разведениях от 1:8 до 1:16, в ИФА - от 1:625 до 1:3125.

Пример 3. Безвредность штамма для лабораторных животных.

Испытания штамма на уровне 5, 7, 10 и 15 пассажей проводили на взрослых белых мышах и морских свинках. На каждый опыт брали по 5 животных. Неразведенный вирус вводили подкожно по 0,5 см³ мышам и внутрибрюшинно по 1 см³ морским свинкам. В течение 10 сут наблюдения признаков заболевания и гибели животных не отмечали.

Пример 4. Безвредность штамма для пушных зверей.

Безвредность штамма 5, 10 и 15 пассажей проверяли на тхорзофретках, которые являются высокочувствительной к ЧП моделью. Испытывали вирус в дозе по 3000-3500 ТЦД 50. На каждый опыт брали по 4 тхорзофретки, которым вводили по 1 см³ вируса внутримышечно.

В период наблюдения (21 сут) все привитые звери остались клинически здоровыми. Каких-либо отклонений от физиологической нормы в поведении и приеме пищи, признаков заболевания и случаев гибели среди зверей не отмечали.

Пример 5. Реактогенность штамма.

Реактогенность штамма 5, 10 и 15 пассажей оценивали в опытах на тхорзофретках, которым вводили внутримышечно по 1 см³ вируса в дозе по 600-700 ТЦД 50. На каждый опыт брали по 4 тхорзофретки и 4 зверя оставили невакцинированными для контроля.

За период наблюдения (21 сут) все привитые звери остались клинически здоровыми, без общей температурной и местной воспалительной реакции на месте введения вируса, без каких-либо отклонений их физиологического состояния от нормы. Контрольные животные также не заболели.

Пример 6. Антигенная активность штамма.

У тхорзофреток, вакцинированных штаммов "ВНИИВВиМ-88" различных пассажей (пример 5), на 20-21 сут после вакцинации отбирали кровь и определяли в пробах сывороток вируснейтрализующие ВН-антитела по реакции нейтрализации в культуре сублинии CV-1. В качестве антигена использовали вирус 4-го пассажа в дозе 1000 ТЦД 50.

У всех вакцинированных тхорзофреток выявили ВН-антитела к вирусу ЧП в титрах 1:32 - 1:64 (и выше) в то время, как титр ВН-антител в пробах нормальной сыворотки составил менее 1:2.

Пример 7. Иммуногенная активность штамма.

Иммуногенную активность штамма различных пассажей оценивали по устойчивости вакцинионированных тхорзофреток к контрольному заражению вирулентным вирусом ЧП.

Через 21 сут после вакцинации (пример 5) иммунизированных и контрольных зверей заражали вирулентные штаммом "Snyder Hill" в дозе 100 ЛД 50 внутримышечно.

Все иммунизированные тхорзофретки оказались устойчивыми к заражению вирулентным вирусом при полной гибели зверей в контроле. В течение 25 сут наблюдения после контрольного заражения у вакцинированных тхорзофреток не наблюдали симптомов заболевания чумой.

Таким образом, новый аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных, адаптированный и выращенный в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1, отвечает всем требованиям, предъявленным к вакцинным штаммам, и может рекомендоваться в качестве производственного при изготовлении высокоактивных, стандартных и дешевых культуральных биопрепаратов, в частности, живой вакцины и специфического антигена.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к аттенуированным вирусам чумы плотоядных, и может быть использовано при изготовлении препаратов для диагностики и специфической профилактики заболевания пушных зверей и собак, вызванного вирусом чумы плотоядных. Новый штамм Virus pestis carnivorum "ВНИИВВиМ - 88 Деп" получен из вакцинного штамма ЭПМ путем адаптации и клонирования в сублинии перевиваемых клеток из почки африканской зеленой мартышки CV-1. Характеризуется высокой репродуцирующей способностью в указанной культуре клеток с проявлением специфического цитопатогенного эффекта, накоплением вирусспецифического антигена и вируса в титрах до 5625 - 31620 ТЦД 50/см³, безвредностью, ареактогенностью, высокой иммуногенной активностью, отсутствием контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Генетически стабилен. Неконтагиозен и нереверсибелен.

Аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных Virus pestis carnivorum, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под номером "ВНИИВВиМ-88 Деп", пригодный для изготовления вакцинных и диагностических препаратовь