ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas putida ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБНЫМИ ФИТОПАТОГЕНАМИ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/40 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями и поэтому может быть использован для защиты от них сельскохозяйственных растений.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1] . Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Н. sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2] и Pseudomonas putida BKM В-1743Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

В качестве прототипа выбран штамм бактерий Pseudomonas species, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alemaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, F. gibbosum, F. sumbucinum [4]. Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, F. gramineamm, F. nivale, F. semitectum, F. solani.

Кроме того, во всех перечисленных аналогах и прототипе нет сведений об активности выделенных штаммов микроорганизмов по отношению к возбудителю наиболее вредоносной болезни пшеницы - твердой головне (Tilletia caries), потери от которой приводят к недобору 10-15% урожая.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром действия на возбудителей грибных заболеваний растений, в том числе и твердой головни.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выделенного из сточных вод в аэротенках биологических очистных сооружений г. Орска. Штамм депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под ИБ 17. Он характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Короткие подвижные палочки, грамотрицательные, спор не образуют. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 суток роста при 28^oС. На мясопептонном агаре (МПА) и на МПА с 2% глицерина - круглые с ровными краями, гладкие, слабо выпуклые, непрозрачные, серовато-белые колонии, диаметром 6-7 мм, пигмент желто-зеленый, флюоресцирующий, диффундирующий в среду.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флюоресцирущих псевдомонад: Кинг А - пигмент отсутствует; Кинг Б - образуется желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду.

В жидких питательных средах (МПБ) образуется обильный, плотный осадок. На МПА-косяках штрих обильный, сплошной с ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - аэроб. Оксидазная реакция положительная. Рост на синтетической среде умеренный. Не разжижает желатин. Не образует индол, леван из сахарозы. Не гидролизует крахмал, лецитин, Твин-80. Не редуцирует нитраты до нитритов. Продуцирует каталазу. Растет при 4^oС. Устойчив к NaCl: pacтет при 6%-ной концентрации.

В качестве источников углерода использует глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, ксилозу, галактозу, рафинозу, арабинозу, рамнозу, пропанол, бутанол, гексанол, пируват, цитрат, ацетат, пропионат, лактат, муравьиную кислоту, изомасляную кислоту, янтарную кислоту, α-кетоглутаровую кислоту, аланин, валин, лейцин, метионин, триптофан, глицерин. Не усваивает оксалат, адипат, малеиновую кислоту, антраниловую кислоту, акриловую кислоту, аминобензойную кислоту, маннит, сорбит, инозит.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1.

Получение биомассы.

Штамм выращивают в течение 48 часов при 28-30^oС с аэрацией до титра 10⁹ КОЕ/мл на среде LB следующего состава, г/л: пептон 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; натрий хлористый 10,0; вода водопроводная до 1 л. При необходимости суспензию клеток разводят водой до необходимого титра.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является более широкий спектр действия на возбудителей грибных заболеваний растений.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Ps. putida ИБ 17.

На пластинки глюкозо-пептонного агара (глюкоза 5 г; пептон 5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный 4 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 2 г; вода дистиллированная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем на эти же пластинки уколом сажают бактерии штамма Ps. putida ИБ 17. Чашки инкубируют при 28^oС в течение 3 суток.

Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей проростков пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Башкирского аграрного университета. Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1•10⁶ клеток на одно зерно, переносят на фильтровальную бумагу, прикрывают полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения жидкости и помещают в лабораторный стакан. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. В качестве эталонов используют Дивиденд стар, Планриз и Фитоспорин. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Эксперименты выполняют в трехкратной повторности, результаты приведены в табл. 2.

В этой же таблице приведены и результаты лабораторных экспериментов, выполненных по аналогичной методике, но с дополнительным внесением в посевной материал спор фитопатогенных грибов Fu-sarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5•10⁴ КОЕ/мл).

Из таблицы 2 следует, что новый штамм как в условиях естественного инфекционного фона заражения, так и в условиях дополнительного заражения посевного материала фитопатогенами превосходит известные биологические препараты Фитоспорин и Планриз в эффективности воздействия на фитопатогены.

Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях полевых испытаний. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. В качестве эталона использовали биологический препарат Фитоспорин. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности. Эффективность штамма определяли при сопосталении степени проявления заболевания растений твердой головней, а также корневыми гнилями в период сбора урожая. Результаты приведены в табл.3.

Из табл. 3 следует, что предпосевная обработка пшеницы суспензией заявляемого штамма бактерий позволила повысить урожайность зерна (на 66,02%). Биологическая эффективность заявляемого штамма при этом превосходит эффективность известного коммерческого препарата Фитоспорин.

Таким образом, использование предлагаемого штамма позволяет обеспечить более широкое антагонистическое действие на фитопатогены, в том числе и на возбудителя твердой головни пшеницы.

Источники информации
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. А 01 N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93,1987.

3. Патент RU 1805849, кл. А 01 N 63/00, 1993.

4. Патент RU 2130261, кл. А 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1999.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается нового штамма Pseudomonas putida 17, который выделен из сточных вод аэротенков биологических очистных сооружений г. Орска. Штамм депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под ИБ 17. Для получения препарата штамм выращивают на среде LB, содержащей, г/л: пептон 10,0; дрожжевой автолизат 5,0; натрий хлористый 10,0, вода до 1 л в течение 48 ч при 28-30^oС с аэрацией до титра 10⁹ КОЕ/мл и полученную суспензию используют для обработки семян пшеницы. Препарат, полученный на основе данного штамма, подавляет развитие заболеваний пшеницы, вызываемых твердой головней и корневыми гнилями. 3 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas putida, депонированный в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ 17, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами.