СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2000 года по МПК C07K14/505 C07K16/22 C12N5/16 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения эритропоэтина человека, и в частности к способу его очистки.

Эритропоэтин является фактором роста предшественников эритроцитов в костном мозге. В организме человека эритропоэтин синтезируется в основном клетками почек и печени; в норме уровень секреции эндогенного эритропоэтина не превышает нескольких десятков международных миллиединиц (mME). При ряде патологий синтез эндогенного эритропоэтина снижается, что приводит к развитию тяжелых анемических состояний. Введение экзогенного эритропоэтина позволяет эффективно восстанавливать эритропоэз, нормализуя состояние пациентов.

Широкое распространение [см., например, заявки PCT 85/03079, 86/03520, патенты ЕПВ N 0148605, 1990, N 0255231, 1992] получили технологии изготовления экзогенного эритропоэтина с помощью рекомбинантных клеточных линий животных, способных секретировать человеческий эритропоэтин при культивировании их in vitro на синтетических питательных средах. При этом уровень продукции эритропоэтина обычно составляет единицы или десятки микрограммов в миллилитре питательной среды, а содержание постороннего белка в ней во много раз выше содержания эритропоэтина. В силу этого для получения субстанции эритропоэтина, пригодной для приготовления препарата медицинского назначения, требуется проведение глубокой очистки.

Известен способ фракционирования рекомбинантного эритропоэтина человека по изоэлектрическим точкам путем препаративного изоэлектрофокусирования [Fuhr, G. et all., BBRS. 1981, v. 98, p. 930]. Указанный способ высокоэффективен, но процесс разделения отличается высокой стоимостью, в результате чего он не нашел широкого применения в биотехнологии. Кроме того, выделенный эритропоэтин требует дополнительной очистки от применяемых при фракционировании растворов.

Также известен способ фракционирования рекомбинантного эритропоэтина человека по количеству сиаловых кислот [заявка ЕПВ N 0428267, 1989, МКИ С 07 К 07/10] , согласно которому формы разделяют с использованием ионообменной хроматографии на носителе Q-Sepharose FF в системе уксусная кислота (150-300 mM) - глицин (1 mM) - мочевина (6 М) с последующей элюцией раствором хлорида натрия. Однако указанный способ является только одной (не последней) стадией многостадийной схемы очистки.

Также известен способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека [патент ЕПВ N 0209539, 1985, МКИ С 07 К 07/10], включающий стадии (1) осаждения части белка этанолом, (2) фракционирования на анионите диэтиламиноэтил-агарозе, (3) разделения на сильном катионите марки SP-Sephadex, (4) гель-фильтрации на Sephadex G-100, (5) хроматографии на гидроксиапатите, (6) концентрирования лиофилизацией и (7) обратнофазной хроматографии на Vydac С-4 в системе вода - трифторуксусная кислота - ацетонитрил. Указанный способ позволяет получить эритропоэтин высокой степени чистоты, однако многостадийность и, вследствие этого, относительно невысокий выход целевого продукта делают его малоэффективным для проведения крупномасштабных препаративных процессов. Кроме того, использование для последней стадии трифторуксусной кислоты, способной даже в используемой концентрации гидролизовать сахарную часть гликопротеидов, крайне нежелательно.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ выделения эритропоэтина из биологических жидкостей [ЕР 0116446, 1990, МПК⁵ C 12 N 5/00], согласно которому иммобилизуют на твердом субстрате моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы мышей, контактируют раствор, содержащий эритропоэтин, с иммобилизованными антителами и элюируют затем эритропоэтин, связанный с иммуносорбентом, раствором 20-членного синтетического олигопептида. Согласно прототипу штамм гибридомы получен иммунизацией мышей тем же 20-членным олигопептидом, синтезированным авторами. В ЕР 0116446 не указывается степень чистоты выделенного указанным способом эритропоэтина. Существенным недостатком известного способа выделения эритропоэтина является необходимость использования весьма дорогого элюента - раствора синтетического 20-членного олигопептида, вызванная низкой специфичностью используемых в процессе моноклональных антител, продуцируемых полученной авторами гибридомой.

Техническая задача, решаемая в заявляемом способе очистки, заключается в упрощении, удешевлении и повышении эффективности процесса выделения эритропоэтина человека.

Поставленная задача решается тем, что в способе очистки эритропоэтина человека, включающем иммобилизацию антител к эритропоэтину на нерастворимой матрице, сорбцию эритропоэтина на иммобилизованных антителах и последующую элюцию эритропоэтина, в качестве антител используют моноклональные антитела, продуцируемые клоном культивируемой гибридомы, выбранным из группы, включающей клоны PCE/F6, PCE/D10 и PCE/D7, причем элюцию эритропоэтина осуществляют кислым буферным раствором с pH менее 4.

Указанные клоны ранее не описаны, получены нами впервые, их свойства и способ получения описаны в примере 1.

Антитела к рекомбинантному эритропоэтину человека иммобилизуют на биосовместимой нерастворимой матрице, например на Sepharose FF фирмы Pharmacia Biotech, активированной бромцианом. Полученный иммуносорбент помещают в колонку, уравновешивая его фосфатным буфером. Через колонку с иммуносорбентом пропускают предварительно осветленную микрофильтрацией культуральную жидкость, содержащую рекомбинантный эритропоэтин. Эритропоэтин, сорбированный на иммуносорбенте, элюируют кислым буферным раствором, например 0.1 М раствором лимонной кислоты, 0.1 М глициновым буфером pH 3.5 и др. Элюент и растворы для промывки могут содержать 0.01 - 0.05 мас.% неионного поверхностно-активного вещества (детергента). В качестве детергента можно использовать детергент марки Tween-20 фирмы Merck, Nonidet Р-40 фирмы Pharmacia и др.

Чистота препарата, достигаемая за одну стадию иммуноаффинной хроматографии в заявляемом способе, составляет более 95%. В случае, если требуется более высокая степень очистки эритропоэтина, элюат, полученный на этой стадии, может быть подвергнут дополнительно сорбции на сильном анионите со ступенчатой элюцией с повышением ионной силы и/или понижением pH элюента или диафильтрации (диализу) против трис-буфера и сорбции на анионите также со ступенчатой элюцией эритропоэтина элюентами возрастающей ионной силы и/или пониженного pH. При дополнительной очистке чистота препарата превышает 98%.

Далее способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Получение и характеристика клонов культивируемой гибридомы мышей.

Для получения коллекции гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к человеческому эритропоэтину, практически гомогенный, не содержащий заметных примесей олигомеров, (см. фиг. 1 и 2) эритропоэтин иммобилизовывали на нитроцеллюлозной мембране, тип HAHY (Millipore, США), гомогенизировали мембрану в диметилсульфоксиде и полученную суспензию вводили мышам линии Balb/c в подушечки задних лап. Спустя 30 дней мышей бустировали внутрибрюшинно раствором эритропоэтина в количестве 10 мкг на 1 мышь. Через 4 дня мышей забивали и лимфоциты из селезенки и лимфоузлов использовали для последующей гибридизации. Слияние лимфоцитов от иммунных мышей проводили по общепринятой процедуре с помощью полиэтиленгликоля. В качестве миеломного партнера при слиянии использовали миелому Px63.Ag8.6.5.3. После слияния клетки переносили в 96-ячеечные микропланшеты при концентрации 10⁵-10⁶ клеток на 1 лунку в селективной питательной среде, содержащей HAT. Спустя 10 дней микропланшеты контролировали микроскопически на присутствие в ячейках растущих колоний клеток. Из ячеек с растущими колониями отбирали образцы культуральной жидкости с целью выявления колоний, продуцирующих антитела, реагирующие с человеческим эритропоэтином.

Скрининг колоний, продуцирующих антитела к человеческому эритропоэтину осуществляли посредством твердофазного иммуноферментного анализа на эритропоэтине, иммобилизованном на поверхности ячеек микропланшетов для иммуноферментного анализа (Costar, Holland, high-bond), по общепринятой процедуре (Engvall, Е. and Perlmann, P., J. Immunology, 109, 129, 1972). Клетки из позитивных ячеек с растущими колониями подвергали клонированию посредством переноса в новые микропланшеты в концентрации 1 - 5 клеток на ячейку. Спустя 10 - 12 дней наличие растущих клонов в микропланшетах контролировали микроскопически и из ячеек с растущими колониями отбирали образцы культуральной жидкости с целью выявления клонов, продуцирующих антитела к человеческому эритропоэтину. Позитивные клоны использовали для дальнейшего клонирования и размножали для депонирования культур. Из 112 первично позитивных колоний в результате процедуры клонирования и скрининга отобрано 3 клона, названных соответственно клонами PCE/D7, PCE/D10 и PCE/F6. Эти клоны характеризовались высокой скоростью роста, высокой стабильностью продукции антител, специфически реагирующих с человеческим эритропоэтином, высоким уровнем продукции антител, доходящим до 50 мкг/мл при культивировании в стационарных условиях. Антитела, продуцируемые полученными гибридомами, подвергали дополнительной характеристике посредством иммунологических и физико-химических процедур. С этой целью из культуральных жидкостей, полученных при накопительном культивировании гибридом PCE/D7, PCE/D10 и PCE/F6 на бессывороточных питательных средах были изолированы посредством гельпроникающей и ионнообменной хроматографии в практически гомогенном состоянии моноклональные антитела, которые были охарактеризованы по следующим параметрам:
- установлен изотип тяжелых цепей иммуноглобулинов с помощью иммуноферментного набора фирмы Calbiochem.

- с помощью иммуноферментного анализа проверена способность моноклональных антител связывать человеческий эритропоэтин из раствора;
- с помощью иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа проверена способность моноклональных антител связываться с компонентами человеческой сыворотки, компонентами бычьей сыворотки, с белками клеток реципиентного штамма CHO, использовавшихся для получения клеточной линии - продуцента эритропоэтина, а также проверена способность моноклональных антител связываться с белками клеток селезенки человека;
- с помощью иммуноферментного конкурентного анализа проверена перекрестная специфичность моноклональных антител;
- проанализирован изоэлектрофокусный спектр моноклональных антител.

Полученные результаты представлены в таблице 1 и на фиг. 3.

Как следует из данных таблицы, все три установленные гибридомы продуцируют моноклональные антитела, которые способны распознавать человеческий эритропоэтин в растворе, имеют IgG1 изотип тяжелой цепи, не конкурируют друг с другом за связывание с молекулой эритропоэтина и, следовательно, распознают в его структуре независимые антигенные детерминанты, не имеют неспецифической иммунореактивности с белками сыворотки крови человека, белками бычьей сыворотки и реципиентной клеточной линии CHO, использовавшейся для получения продуцента эритропоэтина, а также не реагируют с белками клеток человеческой селезенки. Как следует из фиг. 3, моноклональные антитела, продуцируемые установленными гибридомами, характеризуются при изоэлектрофокусировании наличием изоформ, располагающихся в диапазоне pI от 5.3 до 6.0. Таким образом, моноклональные антитела, продуцируемые установленными гибридомами, обладают способностью специфически связывать человеческий эритропоэтин по независимым антигенным детерминантам как в иммобилизованном на твердую фазу состоянии, так и из раствора, не имеют неспецифической иммунореактивности с белками человеческой и бычьей сыворотки, белками клеток CHO и человеческой селезенки и могут быть использованы для очистки человеческого эритропоэтина. Установленные гибридомы депонированы в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всероссийской коллекции клеточных культур под номерами ВСКК/П/634D (штамм PCE/D7), ВСКК/П/635D (штамм PCE/D10) и ВСКК/П/636D (штамм PCE/F6).

Пример 2. Очистка эритропоэтина с использованием иммуносорбента на основе моноклональных антител PCE/D7
Иммуносорбент был приготовлен на основе моноклональных антител, продуцируемых клоном PC/ED7. Для этого 2500 мг моноклональных антител, выделенных из асцитных жидкостей мышей F1 Balb/C/DBA иммобилизовывали на 250 мл CNBr-активированной Sepharose FF по методике изготовителя матрицы и упаковывали в колонку K50/30 (высота столба сорбента 12.7 см). Сорбент уравновешивали фосфатным буфером (PBS), содержащим 0.02% Tween-20.

28 литров культуральной жидкости, содержащей 300 мг rEPO, фронтально наносили на колонку. Сорбент промывали последовательно 4 объемами PBS, содержащим 0.02% Tween-20, 3 объемами фосфатного буфера, содержащего 1 М NaCl и 0.02% Tween-20, и 2 объемами PBS, содержащим 0.02% Tween-20. Элюцию осуществляли 0.1 М раствором лимонной кислоты. Элюат (160 мл, 285 мг, выход - 95%) немедленно нейтрализовывали и подвергали анализу. Элюированный препарат по данным электрофореза и ИФА является эритропоэтином с характерным спектром ИЭФ и чистотой по белку более 95% (фиг. 4). Биологическая активность препарата, определенная согласно примеру 1, составляла 1•10⁵ ME/мг белка.

Пример 3. Очистка эритропоэтина с использованием иммуносорбента на основе моноклональных антител PCE/F6
Приготовленный, как в примере 2, имуносорбент на основе моноклональных антител PC/EF6, выделенных из культуральной жидкости, в количестве 50 мл помещали в колонку K25/30 и уравновешивали PBS, содержащим 0.02% Tween-80.

Осветленную микрофильтрацией культуральную жидкость в количестве 5,2 л, содержащую 50 мг rEPO, концентрировали в 10 раз с использованием половолоконного модуля с проницаемостью 10 KD и фронтально наносили на колонку. Осуществляли промывку колонки и элюцию, как в примере 2, с тем отличием, что в качестве детергента использовали 0.02% Tween-80. Элюат (60 мл, 47 мг, выход - 94%) немедленно нейтрализовывали и подвергали анализу. Элюированный препарат по данным электрофореза и ИФА является эритропоэтином с характерным спектром ИЭФ и чистотой по белку более 95% (фиг. 4). Биологическая активность препарата, определенная, как в примере 1, составляла 1•10⁵ ME/мг белка.

Пример 4. Очистка эритропоэтина с использованием иммуносорбента на основе моноклональных антител PCE/D10
Приготовленный, как в примере 2, имуносорбент на основе моноклональных антител PC/ED10, выделенных из культуральной жидкости, в количестве 60 мл помещали в колонку K25/30 и уравновешивали PBS, содержащим 0.05% Nonidet Р-40.

Осветленную микрофильтрацией культуральную жидкость в количестве 5,2 л, содержащую 50 мг rEPO, концентрировали в 10 раз с использованием плоскорамного модуля с проницаемостью 10 KD и фронтально наносили на колонку. Осуществляли промывку колонки так же, как в примере 3, с тем отличием, что в качестве детергента использовали Nonidet Р-40 (0.05 мас.%). Элюат (75 мл, 46 мг, выход - 92%) немедленно нейтрализовывали и подвергали анализу. Элюированный препарат по данным электрофореза и ИФА является эритропоэтином с характерным спектром ИЭФ и чистотой по белку более 95% (фиг. 4). Биологическая активность препарата, определенная согласно примеру 1, составляла 1•10⁵ ME/мг белка.

Пример 5. Очистка эритропоэтина с дополнительным использованием градиентной ионообменной хроматографии
С целью дальнейшего повышения качества и степени чистоты препарата очищенный по примеру 2 эритропоэтин в количестве 45 мг диализовали против трех смен по 5 литров каждая 0.01 М Трис-буфера pH 7.2, содержащего 0.02% Tween-20, и наносили на колонку K16/30, содержащую 45 мл Q-Sepharose FF, уравновешенную тем же буфером. Колонку промывали тем же буфером и элюировали препарат линейным градиентом NaCl в том же буфере от 0 до 0.3 М. Пик rEPO наблюдался в интервале концентраций NaCl от 0.2 до 0.25 М. По данным анализа (HPLC, IEF, SDS-PAGE) степень чистоты препарата превышала 98%, препарат содержал 8 полос в зонах pI 3.5-5.5. Выход препарата составил 34 мг (75%) (фиг. 5). Биологическая активность препарата, определенная согласно примеру 1, составляла 1.1•10⁵ ME/мг белка.

Пример 6. Очистка эритропоэтина с дополнительным использованием градиентной ионообменной хроматографии
Эритропоэтин, очищенный, как в примере 2, в количестве 43 мг диализовали против трех смен по 5 литров каждая 0.01 М Трис-буфера pH 6.8, содержащего 0.02% Tween-80, и наносили на колонку K16/30, содержащую 45 мл Q-Sepharose FF, уравновешенную тем же буфером. Колонку промывали тем же буфером и элюировали препарат линейным градиентом NaCl в том же буфере от 0 до 0.3 М. Пик rEPO наблюдался в интервале концентраций NaCl от 0.15 до 0.20 М. По данным анализа (HPLC, lEF, SDS-PAGE) степень чистоты препарата превышала 98%, препарат содержал 8 полос в зонах pI 3.5-5.5. Выход препарата составил 31 мг (72%) (фиг. 5). Биологическая активность препарата, определенная, как в примере 1, составляла 0.95•10⁵ ME/мг белка.

Пример 7. Очистка эритропоэтина с дополнительным использованием ионообменной хроматографии и диафильтрации
Для получения препарата эритропоэтина, обогащенного более кислыми формами и обедненного щелочными, и повышения тем самым его качества, а также с целью повышения выхода препарат, полученный по примеру 2, подвергали дополнительной очистке. Для этого rEPO в количестве 280 мг поместили в половолоконный модуль с проницаемостью 10 kD и подвергли диафильтрации против 12 объемов 0.02 М Трис-буфера pH 7.2, содержащего 0.02% Tween-20. Полученный препарат фронтально наносили на колонку K24/30, заполненную 120 мл Q-Sepharose FF, уравновешенную 0.02 М Трис-буфером pH 7.2, содержащим 0.02% Tween-20. Проскок отбрасывали. По окончании сорбции колонку промывали тем же буфером до стабилизации уровня поглощения элюатом при длине волны 280 нм (800 мл). Элюцию щелочных форм rEPO осуществляли 0.01 М ацетатным буфером pH 4.0. Наблюдали ярко выраженный пик. По окончании элюции щелочных форм колонку вновь уравновешивали 0.02 М Трис-буфера pH 7.2, содержащего 0.02% Tween-20. Элюцию кислых форм rEPO осуществляли 0.02 М Трис-буфера pH 7.2, содержащего 0.25 М NaCl и 0.02% Tween-20. Наблюдали острый белковый пик. По данным анализа (HPLC, IEF, SDS-PAGE) степень чистоты препарата превышала 98%, препарат содержал 4 мажорные полосы в зонах pI 3.5-4.5. Выход препарата составил 224 мг (80%) при концентрации 5 мг/мл (фиг. 5, 6). Биологическая активность препарата, определенная согласно примеру 1, составляла 1.38•10⁵ ME/мг белка.

Заявляемый способ позволяет получать препарат эритропоэтина человека, характеризующийся высокой степенью чистоты, практически за одну стадию иммуноаффинной хроматографии. Включение в процесс стадии анионообменной хроматографии позволяет получить эритропоэтин в практически гомогенном состоянии.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения эритропоэтина человека. Способ очистки эритропоэтина человека включает иммобилизацию антител к эритропоэтину на нерастворимой матрице, сорбцию эритропоэтина на иммобилизованных антителах и последующую элюцию эритропоэтина. В качестве антител используют моноклональные антитела, продуцируемые клоном культивируемой гибридомы, выбранным из группы, включающей клоны РСЕ/F6, PCE/D10 и PCE/D7, причем элюцию эритропоэтина осуществляют кислым буферным раствором с рН менее 4, дополнительно используют анионообменную хроматографию. Изобретение позволяет повысить эффективность процесса выделения эритропоэтина человека. 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

1. Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека путем иммуноаффинной хроматографии, включающий иммобилизацию антител к эритропоэтину на нерастворимой матрице, сорбцию эритропоэтина на иммобилизованных антителах и последующую элюцию эритропоэтина, отличающийся тем, что в качестве антител используют моноклональные антитела, продуцируемые клоном культивируемой гибридомы, выбранным из группы, включающей клоны PCE/F6, PCE/D10 и PCE/D7, а элюцию эритропоэтина осуществляют кислым буферным раствором с pH менее 4. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюенты, используемые в иммуноаффинной хроматографии, содержат 0,01 - 0,05 мас.% неионного поверхностно-активного вещества. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что элюцию осуществляют глициновым буфером. 4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюцию осуществляют раствором лимонной кислоты. 5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюат иммуноаффинной хроматографии дополнительно подвергают сорбции на анионите со ступенчатой элюцией эритропоэтина с понижением pH и повышением ионной силы элюента.