СПОСОБ ПОСТАНОВКИ ТВЕРДОФАЗНОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для определения антигенов и антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА на твердой фазе позволяет удалять непрореагировавшие компоненты реакции за счет чего достигается высокая специфичность анализа.

Известен способ постановки ИФА на твердой фазе, в котором на твердой матрице (полистероловом планшете, нитроцеллюлозной пленке) фиксируются антитела, которые обладают способностью связывать специфический антиген, содержащийся в исследуемом материале. В случае положительной реакции после отмывания непрореагировавших компонентов образующийся иммунный комплекс (антитела + антиген) выявляет с помощью иммуноферментного конъюгата (антител, связанных с ферментом) для добавления субстратно-индикаторного раствора, который приобретает окраску под воздействием фермента.

Аналогичным образом по известному антигену можно определять в исследуемом материале антитела (Новые методы иммуноанализа. Ред.У.Коллинз, под ред. А.М. Егорова, "Мир". -М. 1991).

Прототипом является способ постановки твердофазного ИФА для определения антигенов дифтерийного токсина (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения антигенов дифтерийного токсина. Утвержд. зам. нач. Главного управления карантинных инфекций МЗ СССР 23 июля 1987 г.).

Реакция проводится на одноразовых полистироловых 96-луночных планшетах для иммунологических реакций в несколько этапов.

Сенсибилизация планшет индикаторным препаратом.

В лунки планшета пипеточным дозатором вносят раствор антительного препарата (дифтерийного антитоксина) на фосфатно-буферном растворе (ФБР) концентрацией 0,01 моль/л, pH 7,3.

Планшет закрывают крышкой и выдерживают 16-24 часа при температуре 4-10^oC. Затем жидкость удаляют из лунок резким стряхиванием и лунки промывают раствором ФБР с 0,05% твина-20, внося его пипеточным дозатором на 5 минут и снова удаляя резким стряхиванием. Промывание повторяют 3 раза.

Внесение исследуемого материала.

В лунки планшета пипеточным дозатором вносят исследуемый материал (культуральную жидкость, в которой определяют токсин), планшет закрывают крышкой и инкубируют 1 - 1,5 часа при температуре 37^oC.

После выдержки путем отсоса жидкость из лунок удаляют в сосуд с дезраствором и каждую лунку с помощью пипеточного дозатора промывают 3 раза по 5 минут промывающим буферным раствором как указано выше.

Выявление результатов реакции с помощью специфического конъюгата.

В отмытые лунки пипеточным дозатором вносят рабочее разведение специфического конъюгата на ФБР с твином-20, планшет закрывают крышкой и выдерживают 1 - 1,5 часа при температуре 37^oC.

После выдержки жидкость из лунок удаляют резким стряхиванием, каждую лунку промывают трехкратно с помощью пипеточного дозатора и в отмытые лунки пипеточным дозатором вносят субстратно-индикаторный раствор.

Далее по появлению окраски учитывают результаты реакции визуально или помощью спектрофотометра.

Недостатком данного способа постановки твердофазного ИФА являются:
- значительный риск при работе с инфекционным или аллергизирующим материалом, поскольку все манипуляции проводятся в открытом планшете, а удаление избытка жидкости из лунок производится путем резкого стряхивания планшета;
- трудоемкость метода, обусловленная необходимостью для многократных промывок манипулирования пипеточными дозаторами;
- необходимость для выполнения способа оснащения лаборатории планшетами однократного применения, пипеточными дозаторами, наконечниками к ним, а также специальными отсосами (для удаления инфекционного материала из лунок);
- невозможность предварительного концентрирования исследуемого материала непосредственно на твердой фазе в лунке, имеющей ограниченную активно реагирующую поверхность;
- способ мало пригоден для выполнения в полевых условиях, не приспособлен для разовых (индивидуальных) исследований.

Изобретение направлено на решение задачи - упрощение техники постановки твердофазного ИФА, особенно при разовых (индивидуальных) исследованиях, повышение безопасности работы, повышение чувствительности индикации за счет концентрирования исследуемого материала.

Сущность изобретения заключается в том, что ИФА проводится на твердой упругой (пористой, сжимаемой) матрице в ограниченном пространстве, в котором осуществляется обратимая деформация матрицы.

Задача достигается тем, что упругая (пористая, сжимаемая) матрица (например, поролон), сенсибилизированная индикаторным реагентом (антигеном, антителом) и обладающая вследствие пористости большей активной поверхностью, помещается в ограниченное пространство (например, в шприц) и все манипуляции по сенсибилизации твердой фазы, внесению и концентрированию исследуемого материала, специфического конъюгата, субстратно-индикаторного раствора, а также удаление избытка реагентов и промывания твердой фазы на каждом этапе осуществляется как единый цикл операций наполнения и отжима упругой пористой матрицы в ограниченном пространстве.

Способ осуществляется следующим образом:
Приготовление сенсибилизированной твердой упругой матрицы.

Пластину поролона толщиной 2-3 мм в виде рулона высотой около 3-5 см помещают в шприц на 10-20 мл и трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой и 2 раза ФБР концентрацией 0,01 моль/л, pH 7,3, набирая жидкость через иглу и сливая при полном отжиме упругой матрицы.

Через ту же иглу в шприц набирают раствор индикаторных антител в 5%-ном растворе глутарового альдегида так, чтобы поролон был полностью покрыт раствором. После экспозиции в течение 1-2 часов при комнатной температуре матрицу отжимают и 5 раз промывают ФБР, набирая его через ту же иглу и сливая при полном отжиме матрицы.

Отжатую сенсибилизированную матрицу высушивают между слоями фильтровальной бумаги и пробойником нарезают диски-подложки диаметром 5 - 7 мм.

Такую диск-подложку помещают в шприц малой емкости (например, одноразовый на 1,0 мл), в котором будет выполняться реакция.

Шприц с сенсибилизированной подложкой хранится в положении "отжим".

Внесение исследуемого материала и его концентрирование.

В шприц с сенсибилизированной диском-подложкой через иглу набирают исследуемый материал, так чтобы матрица была им полностью покрыта и выдерживают при температуре 37^oC в течение 1 - 1,5 часов.

На пористой матрице (диске-подложке) возможно концентрирование исследуемого материала. Для этого в одном шприце последовательно при тех же условиях экспонируют и отжимают несколько порций исследуемого материала.

Затем упругую матрицу отжимают до отказа и 3 раза промывают через ту же иглу ФБР с твином-20, сливая каждый раз в сосуд с дезраствором.

Выявление результатов с помощью специфического конъюгата.

Сменив иглу, в шприц набирают раствор специфического конъюгата, так чтобы он полностью покрывал упругую матрицу и выдерживают при температуре 37^oC в течение 1 - 1,5 часов. Приводя шприц в положение "отжим", удаляют конъюгат и матрицу 3 раза промывают отмывающим раствором как указано выше.

Сменив иглу, в шприц набирают субстратно-индикаторный раствор, так чтобы он покрывал всю матрицу. При положительной реакции раствор и матрица окрашиваются в коричневый цвет, что регистрируется непосредственно в шприце или отжатый раствор фотометрируется.

Пример 1. Определение дифтерийного анатоксина (модельный опыт с концентрированием исследуемого антигена)
Твердая упругая матрица (поролон) сенсибилизирована антительным препаратом: аффинно очищенными F(ab)₂ - фрагментами противодифтерийного кроличьего иммуноглобулина.

Исследуемый материал - дифтерийный анатоксин, разведенный в 1000-5000 раз.

Конъюгат-аффинно очищенные F(ab)₂ - фрагменты противодифтерийного лошадиного иммуноглобулина, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Хромоген - 5-аминосалициловая кислота.

Реакция проведена в одноразовых шприцах на 1,0 мл.

Пример 2. Определение дифтерийного токсина
Твердая упругая матрица (поролон) сенсибилизирована антительным препаратом: аффинно очищенными F(ab)₂ - фрагментами противодифтерийного кроличьего иммуноглобулина.

Исследуемый материал: а) культура на среде Лингуда штамма Cor.diphtheriae, выделенного от больного Г.

б) культура на среде Лингуда штамма Cor.diphtheriae, выделенного от бактерионосителя III.

Конъюгат - аффинно очищенные F(ab)₂- фрагменты противодифтерийного лошадиного иммуноглобулина, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Хромоген - 5-аминосалициловая кислота.

Пример 3. Определение дифтерийного антитоксина (антител)
Твердая упругая матрица (поролон) сенсибилизирована антигеном- дифтерийным анатоксином.

Исследуемый материал: сыворотка крови кролика, иммунизированного дифтерийным анатоксином.

Конъюгат - аффинно очищенный белок A стафилококка, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Хромоген - 5-аминосалициловая кислота.

Преимущества и положительный эффект способа.

Упрощает технику постановки реакции: не требуется специальных одноразовых планшетов, пипеточных дозаторов, наконечников к ним. Может выполняться в шприцах любого типа, шприцы могут использоваться многократно. Полностью исключается манипуляции с пипеточными дозаторами при многократных промывках твердой фазы.

Повышается безопасность работы: реакция осуществляется в ограниченном пространстве, исключается контакт с компонентами реакции.

Повышается чувствительность индикации за счет концентрирования исследуемого материала непосредственно на упругой пористой матрице.

Способ рекомендуется для разовых индивидуальных анализов, может выполняться в полевых условиях.

Изобретение относится к медицине, а именно лабораторной диагностике, точнее к способу определения антигенов и интител методом твердофазного иммуноферментного анализа. Сущность изобретения состоит в том, что способ осуществляют путем сенсибилизации твердой фазы, внесения исследуемого материала, добавления специфического иммуноферментного конъюгата и субстратно-индикаторного раствора, а также промывания несвязавшегося материала на каждом этапе реакции. Новым в способе является то, что реакцию проводят в ограниченном пространстве с использованием в качестве твердой фазы упругой пористой матрицы, например поролона. Технический результат: упрощение техники постановки твердофазного ИФА, особенно при разовых (индивидуальных) исследованиях, повышение безопасности работы. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ постановки твердофазной иммуноферментной реакции путем сенсибилизации твердой фазы, нанесения исследуемого материала на твердую фазу, добавления к нему специфического иммуноферментного конъюгата и субстратно-индикаторного раствора, а также промывания несвязавшегося материала на каждом этапе реакции, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют упругую пористую матрицу, которую предварительно сенсибилизируют, помещают ее внутрь шприца, где и проводят все этапы иммуноферментной реакции. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве упругой твердой матрицы используют поролон.