СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ ТИПОВ А И В Российский патент 2000 года по МПК G01N33/563 

Изобретение относится к области микробиологии, биохимии и иммунологии и может быть использовано для экстренной серологической диагностики ботулизма, определения источников инфекции, а также для санитарно-гигиенического контроля за производством и хранением пищевых продуктов.

Известен способ биологического тестирования для выявления ботулинических токсинов, включающий метод биологической пробы для определения токсинов и реакцию нейтрализации токсинов для дифференциации типов токсинов на мышах ("Инструкция о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях" N 1135-73 от 20.12.73 г.; "Временные методические рекомендации по лабораторной диагностике ботулизма" N 1129-83 от 07.09.83 г.).

Недостатком данного способа являются трудоемкость, большие сроки учета результатов (72 часа - биопроба и 72 часа - реакция нейтрализации токсинов) и использование большого количества абсолютно здоровых белых мышей определенной массы и возраста, которые являются дефицитными и дорогими.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является способ иммуноферментного определения антигенов, включающий адсорбцию специфических F/ab/₂-фрагментов антител на твердой фазе и выявление антигена с помощью конъюгата специфических F/ab/₂-фрагментов антител с ферментом. (Авторское свидетельство N 1337775, кл. G 01 N 33/53, 1987 г.).

Недостатком данного способа является невозможность дифференциации при определении ботулинических токсинов типов A и B.

Технический результат заключается в создании экономичного экспрессного высокочувствительного метода для индикации и дифференциации ботулинических токсинов типов A и B.

Сущность заключается в создании 2-х иммуноферментных тестов с использованием специфических конъюгатов на основе перекрестно- и аффинноочищенных F/ab/₂-фрагментов, дифференцирующих ботулинические токсины типов A и B.

Способ осуществляется следующим образом.

Иммуноферментное определение ботулинического токсина:
в качестве специфических антител для фиксации на твердой фазе ("подложка") и для конъюгации с ферментом использования перекрестно- и аффинноочищенные дифференцирующие типы токсинов A и B F/ab/₂-фрагменты противоботулинических антител.

Для постановки реакции использовали планшеты одноразового применения. Для фиксации на планшете использовался аффинноочищенные F/ab/₂-фрагменты противоботулинических антител типа A или типа B.

В качестве референс-препарата использовали ботулинический анатоксин типа A или типа B, являющийся антигенным аналогом ботулинического токсина, или ботулинический токсин типа A или типа B, который в разведениях вносили в лунки планшета.

Проявление связавшегося антигена проводили с помощью специфического конъюгата перекрестно- и аффинноочищеных F/ab/₂-фрагментов противоботулинических антител типа A или типа B с пероксидазой хрена в присутствии субстратно-индикаторной смеси. Результаты реакции оценивали по наличию окраски в рабочих лунках.

Пример. Аффинноочищенные F/ab/₂-фрагменты противоботулинических антител типа A или типа B, разведенные в 0,01 М фосфатно-буферном растворе pH 7,3 до концентрации белка 0,01 мг/мл, вносят в лунки планшета и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37^oC. Сенсибилизированные планшеты хранят при температуре 4-6^oC. Для постановки анализа планшеты трехкратно промывают 0,01 М фосфатно-буферным раствором pH 7,3, содержащим 0,05% Твина-20 (далее этот раствор используют на всех этапах постановки реакции). Затем в сенсибилизированные лунки вносят серийные разведения ботулинического анатоксина или токсина соответствующего типа и инкубируют 1,5 ч при 37^oC. После удаления антигена и трехкратного промывания планшета в лунки вносят конъюгат перекрестно- и аффинноочищенных F/ab/₂-фрагментов противоботулинических антител типа A или типа B с пероксидазой хрена в рабочем разведении и инкубируют 1,5 ч при 37^oC. Несвязавшийся конъюгат удаляют, планшеты трехкратного промывают буферным раствором и в лунки добавляют субстратно-индикаторный раствор (5-аминосалициловая кислота или ортофенилендиамин). Результаты реакции оценивают визуально или инструментально при отрицательной реакции в контрольных лунках (подложка + конъюгат; антиген (анатоксин или токсин + конъюгат). На постановку анализа при наличии сенсибилизированных планшетов необходимо 4 ч.

Одномоментно на одном планшете может быть исследовано на наличие ботулинического токсина и определение его типа 80 образцов. При исследовании такого же количества образцов методом биологического тестирования (аналог) для определения токсина необходимо минимум 160 голов белых мышей, а затем для определения типа токсина в реакции нейтрализации также необходимы мыши. Каждый из этих трудоемких тестов дает окончательные результаты в течение 4 суток.

Приведенные данные свидетельствуют об экспрессности и экономичности предлагаемого метода.

При использовании для постановки иммуноферментного анализа для определения ботулинических токсинов тест-систем, включающих F/ab/₂-фрагменты без перекрестной очистки (прототип) не удавалось добиться дифференциации между типами токсинов A и B.

Результаты сравнительной оценки специфичности предлагаемого метода и прототипа приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, разработанные тест-системы высокоспецифичны, то есть не дают перекрестных реакций с гетерологичными токсинами (в тест-системе типа A определяется только токсин типа A, а в тест-системе типа B определяется токсин только типа B), в то время как тест-системы прототипа дают положительные результаты при определении гетерологичных типов токсинов (в тест-системе типа A определяется токсин типа B, а в тест-системе типа B определяется токсин типа A).

Таким образом, при значительном сокращении времени, необходимого на проведение анализа (до 4 часов), удалось добиться дифференциации ботулинических токсинов типа A и типа B.

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и иммунологии и может быть использовано для серологической диагностики ботулизма. Способ включает адсорбцию специфических F/ab/₂ - фрагментов антител типов A и B на тв рдой фазе - планшете, промывание планшета, внесение антигена и инкубацию. После удаления несвязавшегося антигена и промывания планшета вносят противоботулинические конъюгаты, дифференцирующие типы ботулинических токсинов А и В на основе аффинноочищенных F/ab/₂ - фрагментов антител соответствующего типа, подвергнутых перекрестной истощающей иммуносорбции, и инкубируют. Несвязавшиеся конъюгаты удаляют, планшеты промывают и в лунки добавляют индикаторный раствор. Результаты реакции оценивают по наличию окраски в рабочих лунках. Способ обеспечивает ускорение до 4 ч проведения анализа дифференциации токсинов типов A и B. 1 табл.

Способ иммуноферментного определения и дифференциации ботулинических токсинов типов А и В, включающий адсорбцию специфических F/ав/₂-фрагментов антител на твердой фазе и выявление антигена с помощью конъюгата специфических F/ав/₂-фрагментов антител с ферментом, отличающийся тем, что для дифференциации ботулинических токсинов типа А и В используют противоботулинические конъюгаты типа А и типа В на основе аффинноочищенных F/ав/₂-фрагментов антител соответствующего типа, подвергнутых перекрестной истощающей иммуносорбции.