Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа (ИФА), в, иммунодиагностике заболеваний человека и животных, в сероэпидемиоло- гии, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии.

Цель изобретения - повышение точности твердофазного ИФА для определения антител.

Цель достигается тем, что антите- 1осодержащий материал контактируют : твердофазным антигеном в присутствии мочевины в концентрации 0,5 - 2,0 моль/л и обработанной пепсином сыворотки крови млекопитающих в конечной ее концентрации 1%, а в рабочий раствор конъюгата белок А-перокс.идазд вносят мочевину в концентрации 0,2-0,5 моль/л.

Способ осуществляется следующим образом.

1.1.Твердофазный антиген получают посредством сорбции антигена в полистирольных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций (Ленинградский завод Медполимер). Раствор антигена в объеме 0,1 мл выдерживают в лунках планшета 8 ч при 4°С, после чего его удаляют.

1.2.Для блокады остаточной сорбции в лунках вносят в них по 0,15 мл 0,5 %-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в глициновом буферном растворе (ГБР) следующего состава, моль/л: глицин 0,1; хлорид

СП

о© с&

00

натрия 0,15, рН 3,2. Этот раствор выдерживают в лунках 1 ч при 20-24°С, затем удаляют.

1.3.Проводят 4-кратную промывку лунок рабочим буферным раствором

(РБР) следующего состава: фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) 0,01 моль/л; хлорид натрия 1%; БСА 0,05%; твин-20 0,05%. На каждую про- мывку расходуют по 0,15 мл РБР.

1.4.Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки: согласно прототипу - сыворотки предварительно разводят в 100 раз рабочим буфер- ным раствором и вносят в лунки в объеме 0,1 мл; согласно предлагаемому способу - первичные неразведенные сыворотки вносят непосредственно в лунки планшета в объеме 0,01 мл и добавляют 0,09 мл разбавляющего раствора (РР) следующего состава: мочевина 1,0 моль/л; хлорид натрия

0,15 моль/л; твин-20 0,5 г/л; нормальная лошадиная сыворотка,обрабо- тайная пепенсином 10 мл/л PP.

Обработку нормальной лошадиной сыворотки производят предварительно, заготавливая впрок. Для ее получения к нативной сыворотке добавляют крис- таллическую лимонную кислоту до рН 4,0-4,5 и 5 мг/мл пепсина очищенного кристаллического. Смесь выдерживают при 18-24°С 1 ч и прогревают при 53° С 45 мин, затем центрифугируют при 4-5 тыс.об. 30 мин, осадок удаляют, а надосадочный слой диализуют против 0,2 М фосфатно-буферного раствора рН 8,2. Полученную диализованную ферментированную сыворотку хранят в присутствии мертиолата (при его конечной концентрации 0,01%) в течение 1 г.

Исследуемые сыворотки выдерживают в лунках планшета 30 мин при 37°С,за- тем содержимое лунок удаляют и проводят промывку (как указано в п.1.3).

1.5.В лунки планшета вносят конъюгат белок А-пероксидаза хрена (производства ЛенНИИЭМ им.Пастера), приготовленный на РБР,содержащем

0,2 моль/л мочевины. Концентрация конъюгата - 100 нг действующего начат ла на 1 мл раствора; объем, вносимый в лунку, - 0,1 мл. Раствор конъю- гата выдерживают в лунках 15 мин при 13-24°С и повторяют промывки (п. 1.3),

1.6.В лунки планшета вносят по О,1 мл хромогенсубстратной смеси,

приготовленной непосредственно перед использованием следующим образом: в 10 мл 0,2 моль/л цитратно-фосфатного буфера рН 5,0 растворяют 1 мг ортофе- нилендиамина и 0,01 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Смесь выдерживают в лунках I5 мин в темноте при 13-2ч°С, затем реакцию останавливают добавлением 4н. раствора серной кислоты по 0,1 мл в каждую минуту и результаты анализа фотометрируют на спектрофотометре любой конструкции (Мультискан, АИФ-Ц-0.1С и т.п.) при длине волны проходящего света 492 нм.

1.7. Уровень фонового сигнала определяют в контрольных лунках планшета, в которых выполняют все изложенные операции, за исключением операции 1.1, т.е. антиген не сорбируют в лунке планшета.

1.3. Результаты учитывают следующим образом: положительными считают те реакции, в которых оптическая плотность продукта реакции выше таковой в контрольной лунке (выше фонового сигнала той же сыворотки) в 2,5 и более раз; сомнительными - реакции, где оптическая плотность выше фонового сигнала менее, чем в 2,5, но не более, чем в 2 раза; отрицательными - реакции, в которых оптическая плотность выше фонового сигнала менее, чем в 2 раза.

Пример. Определяют противодифтерийные антитела в сыворотках подростков 13-14 лет; а) в группе сывороток, содержащих антитоксические антитела в количествах 0,1-0,3 Me/мл по результатам предварительно проведенной биопробы на кроликах; б) в группе сывороток, не содержащих антитоксических антител по данным той же биопробы.

Твердофазный антиген получают посредством сорбции дифтерийного анатоксина (0,1 мл раствора, содержащего 5 мкг антигена-анатоксина в 1 мл в ГБР) в течение 18 ч при 3°С.

Bet; остальные операции анализа проводят, как изложено в пп. 1.2-1.8 с теми отличиями, что на стадии контактирования исследуемой сыворотки с твердофазными антигеном варьируют состав РР - используют ферментированные и неферментированные сыворотки разных видов и в разной концентрации

51

Результаты зависимости от характера и концентрации сыворотки,вводимой в разбавляющий раствор,предсталены в табл.1 (свидетельствуют о более высокой точности).

Все 54 серопозитивные сыворотки предлагаемого способа по сравнению с прототипом тестируются правильно, все серонегативные не дают ложно- положительных результатов. В прототипе 5 сывороток ошибочно тестируются как отрицательные и 2 - как сомнительные (вариант 9).

Положительный эффект в предлагаемом способе достигается при использовании ферментированной сыворотки лошади и кролика - без существенных различий между вариантами 1 и 2. Не- ферментировалная (нативная) сыворот- Ра (вариант 3) не дает эгЬфекта существенного улучшения НФА: 6 геропо- ЗИТИРНЫХ и 3 серонегативных сыворотки определяются как сомнительные ввиду высокого уровня фонового сигнала. Без добавления сыворотки (вариант 4) возрастает число проб с высоким фоновым сигналом, в результате точного анализа хуже, чем в прототипе.

Варианты 6-7 демонстрируют зависимость результата ИФА от концентрации ферментированной сыворотки в составе PP. Надежный эффект повышения точности ИФА отмечают при концентрации ферментированной сыворотки 1%, более высокие ее концентрации существенного эффекта снижения фонового сигнала не дают, поэтому нецелесообразны.

Вариант 8 демонстрирует тот факт, что ферментированная сыворотка дает эффект повышения точности ИФА только в сочетании с мочевиной в составе PP. В отсуствие мочевины из-за высокого уровня фонового сигнала 2 из 4 тестируются как отрицательные и 6 проб - как сомнительные.

П р и м е р 2. Определяют противодифтерийные антитела в 51 сыворотке, положительной по данным антитоксического теста на кроликах.

Условия проведения и зависимость результатов ИФА от вводимых ингредиентов рабочих растворов и их концентрации, приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, положительный эффект повышения точности и сни3936

жения фонового сигнала дает применение в составе РР мочевины в концентрациях 0,5-2,0 моль/л (в сочетании с 1%-ной ферментированной сывороткой лошади или быка). Более высокие концентрации мочевины снижают специфический сигнал и приводят к появлению сомнительных и отрицательных

Q результатов.

Варианты 14-18 данного примера доказывают положительный эффект,созданный в предлагаемом способе при- сутствием мочевины в рабочем раство5 ре конъюгата, начиная с ее концентрации 0,2 моль/л и до концентрации 0,5 моль/л. Дальнейшее увеличение концентрации мочевины не дает положительного эффекта, а, напротив,сни0 жает абсолютный уровень специфического сигнала.

П р и м е р 3. Определяют антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ). В качестве ВИЧ-положительных

5 и ВИЧ-отрицательных сывороток крови беременных женщин используют образцы сывороток из набора ГИСК МЗ СССР (подтвержденных совпадающими данными ИФА с референс-тестсистемами и данны0 ми иммуноблоттинга).

Твердофазный антиген готовят из синтетических пептидов-аналогов антигенных детерминант ВИЧ из набора тестсистемы Эпитоп путем их сорбции в лунках планшета для иммунологических исследований в концентрации 15 мкг пептидов в 1 мл. Далее ИФА выполняют, как указано в пп.1.1 - 1.3. Получают доказательства повы0 шения точности и специфичности предлагаемого способа, который дает полное выявление всех сероположнтель- ных лиц (на 5 человек больше, чем прототип) и лишен ложноположитель5 ных результатов при анализе сывороток беременных женщин (прототип и этой группе обследуемых регистрирует 6 случаев ложноположительных реакций и 2 случая сомнительных - 6% и

0 2% - соответственно от объема выборки) .

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность исключить ложнопо- ложительные реакции и дополнительно

5 выявить носителей антител к ВИЧ. Оба преимущества имеют принципиально важное значение для правильной организации противоэпидемических мероприя тий против СПИД.

5

П р и м е р 4. Выполняют в точном соответствии с предыдущим примером, исследуя тот же материал на наличие антител к ВИЧ. Отличие состоит в том, что для получения твердофазного антигена используют антигенные детерминанты ВИЧ из иммунодиагности :,. .-кой тестсистемы Пептоскрин-1. Получают следующие результаты: из 100 ис- следуемых ВИЧ положительных сывороток известным способом правильно тестируют 88 (88%), 12 сывороток (12%) тестируют как отрицательные. Все сыворотки здоровых доноров и беремен- ных женщин известным способом тестируются как отрицательные.

Предлагаемый способ правильно тестирует 93 ВИЧ-положительных сывороток из 100, т.е. точность способа повышается до уровня рекомендованного комитетом экспертов Всемирной Организации Здравоохранения. Сыворотки здоровых доноров и беременных женщин тестируются без ошибок как от- рицательные.

Таким образом, выполненные примеры демонстрируют повышение точности . Кроме того, важными являются еще

два результата - снижение уровня фонового сигнала в ИФА и снижение его трудоемкости за счет устранения операции промежуточного разбавления исследуемой сыворотки). Способ осуществим при определении антител различной специфичности и различных биологических видов.

Формула изобретения

Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе, включающий сорбцию антигена на твердой фазе, внесение исследуемых антител и детекцию комплекса антиген - антитело в пробе с помощью обработки раствором конъюгата белок А-перок- сидаза и спектрофотометрической регистрации продукта пероксидазной реакции, отличающийся т.ем, что, с целью повышения точности определения после внесения исследуемы антител в пробу добавляют раствор, содержащий 0,5-2,0 М мочевину и обработанную пепсином сыворотку крови млекопитающих и концентрации 1-2%, а в раствор конъюгата вносят мочевину в концентрации 0,2-0,5 М.

Т а в л и ц а 1

1645898

10 Продолжение табл.1

Изобретение относится к иммунодиагностике и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа и иммунодиагностике заболеваний человека и животных, в сероэпидемио логин, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии. Цель изобретения заключается в повышении точности определения антител в твердофазном иммунофермснтном анализе. Сущность изобоетения заключается в том, что поел0 сорбции антигена на твердой фазе и янесения исследуемых антител в пробу добавляют раствор, содержащий 0,5-2,ОМ мочевину и обработанную пепсином сыворотку крови млекопитаю- ших и концентрации 1-2%, а в раствор конъюгата белок А-пероксидаза вносят мочевину в концентрации 0,2-0,5М.Повышение точности определения антител подтверждено примерами. 2 табл. f.

Примечание: оптическая плотность продукта реакции при длине волны 492 ни; М - мода - средний уровень ОД 491 по гРУппе сыворотки.

г

19

5

19

Т«влнц«2