СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ Российский патент 2004 года по МПК A23L1/30 A23J1/18 

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано в производстве добавок к пищевым продуктам, обладающим повышенной питательной ценностью и лечебно-профилактическими свойствами.

Известен способ получения лечебно-профилактической добавки из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae (vini) ВКПМ У-511, выращенных на питательных средах с использованием растительного (зернового или соевого) сырья или отходов переработки молочного сырья. Полученную после выращивания дрожжей культуру инактивируют и подвергают сушке. Данный продукт используется для регулирования моторики кишечника за счет способности к нейтрализации токсичных метаболитов патогенных и условно-патогенных бактерий желудочно-кишечного тракта [1].

Однако дрожжи с повышенным содержанием липидов при хранении подвергаются порче и могут обладать токсичными свойствами при наличии в их биомассе жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов. Повышенное содержание нуклеиновых кислот в пищевой добавке может вызвать увеличение уровня азота в крови потребителя с возникновения заболеваний, связанных с образованием уреатов.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является способ получения биологически активной добавки (БАД), включающий экстракцию из биомассы хлебопекарных дрожжей липидов и нуклеиновых кислот, смешивание полученного щелочного экстракта белка с сепарированным молоком, выделение полученного белкового осадка и сушку полученного изолята [2].

Однако щелочная экстракция нуклеиновых кислот при рН 9,5-12,0 приводит к уменьшению аминокислотного скора белка, в результате чего белок, выделенный при рН 12,0, лимитирован по сумме цистеин + метионин, а также по сумме ароматических аминокислот и изолейцину; кроме того, в концентрате, выделенном при рН 12,0, наблюдается образование D-аминокислот.

Задачей данного изобретения является повышение качества пищевой БАД путем удаления из биомассы нежелательных внутриклеточных компонентов, сохранения углеводов клеточной стенки дрожжей для придания добавке сорбционных свойств по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре.

Поставленная задача достигается тем, что в способе производства БАД, включающем экстракцию из биомассы хлебопекарных дрожжей липидов и нуклеиновых кислот, отличием является то, что биомассу хлебопекарных дрожжей перед экстракцией подвергают обработке 0,001-0,01% раствором ферментного препарата гидролитического действия, экстракцию липидов осуществляют в три стадии, каждую из которых проводят в течение 25-30 мин при температуре 45-50°С, соотношение биомасса : спиртовой раствор составляет 1:6-8 в пересчете на абсолютно сухое вещество, полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8-10, гидролиз нуклеиновых кислот и экстракцию нуклеотидов проводят при температуре 40-50°С, в течение 50-60 мин, при соотношении биомасса : экстрагент 1:4-5 в пересчете на абсолютно сухое вещество и рН 8,0-9,0, полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода = 1:8-10 и высушивают при 80-85°С под вакуумом.

Отличием является также то, что биомассу хлебопекарных дрожжей выращивают на мелассно-солевой питательной среде, а также то, что при выращивании хлебопекарных дрожжей в культуральную жидкость через 6-8 ч от начала культивирования вносят стимулятор роста полифенольной природы.

Для выращивания дрожжей используется мелассно-солевая питательная среды, т.е. свекловичная меласса является основным источником углерода и питательных веществ в среде для выращивания дрожжей. Однако химический состав мелассы непостоянен, так как зависит от множества факторов, поэтому в питательные среды необходимо дополнительно вносить источники минерального питания, в частности азот и фосфор. Содержание азота в среде должны быть высоким, так как в сухой биомассе дрожжей содержится 45-55% белка. Недостаток азота приводит к повышенному синтезу липидов в клетке за счет уменьшения белковой и аминокислотной фракций. При недостатке фосфора в среде происходит снижение накопления биомассы и уменьшение в ней фракции белка.

Стимулятор роста полифенольной природы вводится в питательные среды при выращивании дрожжей через 6-8 ч от начала культивирования для увеличения выхода белка и накопления биомассы за счет пролонгирования экспоненциальной фазы роста.

Дрожжевую суспензию обрабатывают 0,001-0,01% раствором ферментного препарата гидролитического действия для частичного разрушения клеточной стенки, ускорения и облегчения выделения белка и внутриклеточных компонентов. Существуют также иные методы разрушения клеточных стенок дрожжей: механические, гидролиз в сильнокислой или сильнощелочной среде. При этом полное разрушение клеточной стенки происходит в таких условиях, которые приводят к потере биологической ценности получаемого белка. Сохранение полисахаридов клеточной стенки также придает получаемому продукту пребиотические свойства, т.е. способность сорбировать и удалять из организма человека представителей патогенной микрофлоры, продукты ее жизнедеятельности, а также тяжелые металлы за счет связывания последних с углеводами клеточной стенки.

Экстракцию липидов проводят раствором этилового спирта, т.к. ввиду использования БАД в пищевых целях, растворитель должен быть разрешен к использованию в пищевой промышленности. Липиды микроорганизмов характеризуются сложным фракционным составом, при этом на долю наиболее реакционноспособных фосфолипидов приходится почти 50%. Поэтому для более полного удаления липидов экстракцию проводят органическими полярными растворителями.

Промывание полученного после экстракции липидов осадка необходимо для более полного удаления экстрагируемых веществ и экстрагента.

Проведение гидролиза нуклеиновых кислот при выбранных параметрах (при температуре 40-50°С, в течение 50-60 мин, при соотношении биомасса : экстрагент 1:4-5 в пересчете на абсолютно сухое вещество, и рН 8,0-9,0) необходимо для сохранения нативного состава белка. Экстракция нуклеиновых кислот проводится для повышения качества БАД, так как их избыточное поступление в организм человека приводит к отложению уреатов, что связано с особенностями пуринового обмена.

Промывку полученного после экстракции нуклеиновых кислот осадка осуществляют для того, чтобы удалить остатки экстрагента с повышенным значением рН.

В состав полученной БАД, кроме белка, входят глюканы и маннаны клеточных стенок дрожжей, обладающие способностью сорбировать и выводить из желудочно-кишечного тракта токсичные метаболиты, патогенные и условно-патогенные бактерии.

Для значительного большинства энтеробактерий кишечный тракт позвоночных животных и человека является естественной средой обитания. В организме человека ряд энтеробактерий входит в состав микробных биоценозов толстого и тонкого кишечника. Патогенные виды встречаются только у больных и бактерионосителей.

При лабораторных исследованиях обычно используются непатогенные представители сем. Enterobacteriaceae - штаммы Escherichia coli.

Среди бактерий сем. Pseudomonadaceae есть виды (Ps. fluoresceus), способные вызвать заболевания. Описан псевдомонадный энтерит, возникший при употреблении контаминированной возбудителем воды. Клинически он сходен с симптомами, характерными для брюшного тифа. У таких больных количество псевдомонад может достигать 50-75% от всей микрофлоры фекалий.

В госпитальных условиях (особенно в онкологических стационарах, а также в отделениях терапевтического профиля) наиболее опасен некротизирующий колит, вызываемый псевдомонадами. Чаще всего поражается аппендикс, хотя в процесс может быть вовлечен весь толстый кишечник.

Псевдомонады способны вызывать различную по интенсивности диарею у новорожденных. В небольшом количестве (0,1%) псевдомонады присутствуют в кишечнике у 5-20% здоровых людей.

У онкологических больных в связи с длительным применением антибиотиков, стероидных и цитостатических препаратов, отрицательно влияющих как на кишечный биоценоз, так и на регенеративную способность слизистой кишечника, происходит селективное размножение и инвазия псевдомонад. Значительное число микробов в фекалиях таких больных при определенных условиях может становиться эпидемически значимым при формировании очага внутрибольничной инфекции.

Представители сем. Micrococcus, в частности рода Staphilococcus, являются представителями нормальной микрофлоры кожи человека, дыхательных путей и пищеварительного тракта; их постоянно обнаруживают в воздухе и окружающей среде. Патогенные свойства конкретного штамма стафилококка определяются стимулирующим действием экзо- и энтеротоксинов и ферментов (лейкоцидина, коагулазы). Наличие у St. aureus энтеротоксина обусловливает возникновение широко распространенного типа пищевых токсикоинфекций.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу хлебопекарных дрожжей выращивают на мелассно-солевой питательной среде. В качестве источника азота в среде используют соль (NH₄)₂SO₄ в количестве 2 г/дм³, в качестве источника фосфора КН₂РO₄ в количестве 0,6 г/дм³. Приготовленную мелассно-солевую питательную среду с содержанием сухих веществ 10% стерилизуют и засевают чистой культурой пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae JIBЗ. Стимулятор роста биомассы, в частности Гипоксен, вносят в кулыуральную жидкость в виде стерильного раствора через 6-8 ч после засева чистой культурой дрожжей. Продолжительность культивирования 24 ч. Выросшую биомассу дрожжей отделяют от питательной среды путем центрифугирования. В 2% водную суспензию биомассы хлебопекарных дрожжей, перед экстракцией из нее липидов, вводят 0,001-0,01% ферментного препарата гидролитического действия. Далее проводят трехстадийную экстракцию липидов. Каждую из стадий проводят водным pacтвором этилового спирта в течение 25-30 мин при температуре 45-50°С и соотношении биомасса : спиртовой раствор 1:8-10 в пересчете на абсолютно сухое вещество. После проведения экстракции полученный осадок отделяют от экстрагента и промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8-10. Далее осуществляют гидролиз нуклеиновых кислот. Экстракцию гиролизованных нуклеиновых кислот проводят при температуре 40-50°С, в течение 50-60 мин, при соотношении биомасса : экстрагент 1:4-5 в пересчете на абсолютно сухое вещество, и рН экстрагента 8,0-9,0. Полученный осадок отделяют от раствора нуклеотидов и промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8-10. Полученную БАД высушивают при 80-85°С под вакуумом.

Пример 1

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ЛВЗ выращивают на мелассно-солевой питательной среде с содержанием сухих веществ 10% в течение 24 ч при температуре 30°С в аэробных условиях. Стимулятор роста полифенольной природы Гипоксен вводится в культуральную жидкость через 6 ч от начала культивирования в концентрации 3 мг/дм³. Выросшие дрожжи отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования. Содержание "сырого протеина" в полученных дрожжах 53,1-53,9%, липидов 9,0-10,0%, нуклеиновых кислот 8,0%. Полученную после выращивания биомассу дрожжей обрабатывают 0,01%-ным раствором комплекса ферментов гидролитического действия. Для инактивации ферментов биомассу с частично разрушенной клеточной стенкой отделяют центрифугированием и высушивают до конечной влажности 5%. Далее осуществляют экстракцию липидов из биомассы дрожжей 40%-ным этанолом в три стадии. Каждую из стадий проводят в течение 30 мин при температуре 50°С и соотношении биомасса : спиртовой раствор = 1:8 в пересчете на абсолютно сухое вещество. Полученный после экстракции осадок отделяют от экстрагента и промывают водой при соотношении осадок : вода = 1:10. Далее проводят экстракцию нуклеиновых кислот из промытой и обезжиренной биомассы. Для этого к промытому осадку добавляют 5, к пересчете на АСБ дрожжей, объемов щелочного раствора с рН 8,0 (содержание сухих веществ в суспензии составляет 16%). Гидролиз нуклеиновых кислот и экстракцию нуклеотидов ведут в течение 60 мин при температуре 50°С. Затем экстракт отделяют от биомассы дрожжей центрифугированием, промывают водой для удаления остатков экстрагента при соотношении осадок: вода 1:10 и снова центрифугируют. Полученный осадок влажностью 75% высушивают при температуре 80°С под вакуумом.

Полученная БАД содержит "сырого протеина" - 64,0%, липидов - 1,65%, нуклеиновых кислот - 2,30%, углеводов - 20,0%. Растворимость добавки при рН 4,5-8,5 составляет 25,3-32,4%.

Пример 2

Выращивание хлебопекарных дрожжей, обработку полученной биомассы раствором комплекса ферментов гидролитического действия и инактивацию фермента проводят, как описано в примере 1. Далее осуществляют экстракцию липидов из биомассы дрожжей 40%-ным этанолом в три стадии. Каждую из стадий проводят в течение 25 мин, температура экстракции составляет 40°С, соотношение биомасса : спиртовой раствор равно 1:6 в пересчете на абсолютно сухое вещество. Полученный после экстракции осадок отделяют от экстрагента и промывают водой при соотношении осадок : вода = 1:8. Далее осуществляют экстракцию из обезжиренной биомассы нуклеиновых кислот. Гидролиз нуклеиновых кислот и экстракцию нуклеотидов ведут в течение 50 мин при температуре 40°С при соотношении биомасса : экстрагент 1:4 (содержание сухих веществ в суспензии 20%) и рН экстрагента 8,0. По окончании времени гидролиза экстракт отделяют от биомассы дрожжей центрифугированием, промывают водой для удаления остатков экстрагента при соотношении осадок : вода 1:8 и снова центрифугируют. Полученный осадок влажностью 75% высушивают при температуре 85°С под вакуумом.

Полученная БАД содержит "сырого протеина" - 63,0%, липидов - 1,68%, нуклеиновых кислот - 2,40%, углеводов - 20,5%. Растворимость добавки при рН 4,5-8,5 составляет 21,9-27,5%.

Пример 3

Выращивание хлебопекарных дрожжей проводят, как указано в примере 1. Полученную после выращивания биомассу дрожжей обрабатывают 0,001%-ным раствором комплекса ферментов гидролитического действия. Инактивацию ферментного препарата, экстракцию из дрожжевой биомассы липидов и нуклеиновых кислот, промывку осадков от экстрагентов и высушивание полученной биологически активной добавки осуществляют, как описано в примере 1.

Полученная БАД, в зависимости от используемого ферментного препарата, содержит 58,0% "сырого протеина", 2,4% липидов, 2,8% нуклеиновых кислот и 21% углеводов. Растворимость добавки при рН 4,5-8,5 составляет 10,1-15,3%.

Пример 4

Выращивание хлебопекарных дрожжей проводят, как описано в примере 1. Экстракцию из дрожжевой биомассы липидов и нуклеиновых кислот, промывку осадков от экстрагентов и высушивание полученного осадка влажностью 75% осуществляют, как описано в примере 1.

Полученная БАД содержит 60,0% "сырого протеина", 2,18% липидов, 2,6% нуклеиновых кислот и 21% углеводов. Растворимость добавки при рН 4,5-8,5 составляет 20,3-28,4%.

Пример 5

Выращивание хлебопекарных дрожжей проводят, как описано в примере 1. Экстракцию из дрожжевой биомассы липидов и нуклеиновых кислот, промывку осадков от экстрагентов и высушивание полученного осадка влажностью 75% осуществляют при параметрах, описанных в примере 2.

Полученная БАД содержит "сырого протеина" - 60,0%, липидов - 2,28%, нуклеиновых кислот - 2,7%, углеводов - 21,0%. Растворимость добавки при рН 4,5-8,5 составляет 11,8-18,5%.

Была определена сорбционная способность БАД по бактериальной нагрузке на 1 г препарата, равной 2-9х10⁵ клеток. Использовались чистые культуры Е. coli, Ps. fluorescens и St. aureus. Полученные значения сорбционной способности выражали в процентах по отношению к начальному количеству клеток микроорганизмов в растворе: по Е. coli - 43-51%, по St. aureus - 33-43%, по Ps. fluoresceus - 33-38%.

Полученные БАД были использованы для повышения биологической ценности при выпечке хлебобулочных изделий. Для этого добавку вводили в рецептуру хлеба в количестве 5% от массы изделия. Рецептуры и режим приготовления хлебобулочных изделий безопарным способом приведены в таблице 1. Контролем служили хлебобулочные изделия, приготовленные по традиционной рецептуре; вариант 1 - хлебобулочные изделия, в рецептуру которых вносили 5% БАД с предварительной предобработкой биомассы хлебопекарных дрожжей раствором ферментного препарата, полученной по способу, описанному в примере 1. Органолептическая и физико-химическая оценка полученных хлебобулочных изделий приведена в таблице 2. Использование БАД в рецептурах хлебобулочных изделий позволит повысить содержание белка в них на 25,82%, а аминокислотный скор незаменимых аминокислот - в среднем на 22-50%.

Использование предлагаемого способа позволит улучшить качество получаемой БАД: повысить содержание белка (до содержания 58,0-64,0%), снизить содержание липидов до 1,65-2,40% и нуклеиновых кислот до 2,3-2,8%. Растворимость препарата составляет 10,1-32,4%, сорбционная способность составляет 33-51% в зависимости от вида микроорганизмов.

Предложенная БАД может быть использована в хлебопекарной и пищеконцентратной промышленности.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано в производстве добавок к пищевым продуктам, обладающим повышенной питательной ценностью. Предложен способ производства биологически активной добавки к пище. Способ осуществляется следующим образом. Биомассу хлебопекарных дрожжей выращивают на мелассно-солевой питательной среде. Через 6-8 ч от начала культивирования в культуральную жидкость вносят стимулятор роста полифенольной природы. Дрожжевую суспензию обрабатывают 0,001-0,01% раствором ферментного препарата гидролитического действия. Далее проводят трехстадийную экстракцию липидов в течение 25-30 мин при температуре 40-50°С, соотношение биомасса : спиртовой раствор составляет 1:6-8. Полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8-10. Далее осуществляют гидролиз нуклеиновых кислот и экстракцию нуклеотидов при температуре 40-50°С, в течение 50-60 мин, при соотношении биомасса : экстрагент 1:4-5 и рН 8,0-9,0. Полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8-10 и высушивают при 80-85°С под вакуумом. Изобретение позволяет повысить качество добавки путем удаления из биомассы нежелательных внутрикислотных компонентов. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ производства биологически активной добавки, включающий экстракцию из биомассы хлебопекарных дрожжей липидов и нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что биомассу хлебопекарных дрожжей перед экстракцией подвергают обработке 0,001-0,01%-ным раствором ферментного препарата гидролитического действия, экстракцию липидов осуществляют в три стадии, каждую из которых проводят в течение 25-30 мин при температуре 40-50°С, соотношение биомасса : спиртовой раствор составляет 1:6÷8 в пересчете на абсолютно сухое вещество, полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8÷10, гидролиз нуклеиновых кислот и экстракцию нуклеотидов проводят при температуре 40-50°С, в течение 50-60 мин, при соотношении биомасса : экстрагент 1:4÷5 в пересчете на абсолютно сухое вещество, и рН 8,0-9,0, полученный осадок отделяют от экстрагента, промывают водой при соотношении осадок : вода 1:8÷10 и высушивают при 80-85°С под вакуумом.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биомассу хлебопекарных дрожжей выращивают на мелассно-солевой питательной среде.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выращивании хлебопекарных дрожжей в культуральную жидкость через 6-8 ч от начала культивирования вносят стимулятор роста полифенольной природы.