СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12N7/06 A61K39/12 

Изобретение относится к медицине, в частности предназначено для инактивации вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) в биологических жидкостях и других биологических материалах для получения антигена, используемого в диагностических тест-системах, а также для иммунизации лабораторных животных с целью получения иммунного ответа и вакцинопрофилактики.

Известен способ инактивации ВИЧ-1 для получения антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах путем введения в вирусосодержащую суспензию (вирус выращивают на лимфоцитах человека МТ-4) твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией не менее 24 часов при температуре 6^oC (авт. свид. СССР N 1717631, МКИ C 12 N 7/00, опубл. 07.03.92).

Недостатком данного способа является длительность процесса инактивации вируса, цитотоксическое действие твина-80 на культуры клеток, а при иммунизации полученным антигеном животных могут наблюдаться аллергические реакции.

Известен способ инактивации вируса, включающий ведение в суспензию культуры клеток, инфицированных вирусом бешенства, раствора этанола в конечной концентрации 20% инкубирование смеси при 30-31^oC в течение 12-14 суток (авт. свид. СССР N 770196, МКИ C 12 N 7/00, 07.04.83).

Недостатком способа является длительность процесса инактивации вируса и высокая концентрация этанола в суспензии, что может вызвать цитотоксическое действие реагента на культуру клеток.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ ингибирования инфекционной активности ВИЧ-1, включающий обработку вирусосодержащей суспензии культур клеток человека или животных этанолом в конечной концентрации не менее 70% с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре (СПИД в акушерстве и перинатологии// Учебное пособие для студентов, субординаторов, врачей-интернов и слушателей ФУВ. - Минздрав РФ, Хабаровск, 1992, с. 31).

Недостатком прототипа является высокая концентрация этанола в вирусосодержащей суспензии, что может вызвать цитотоксическое действие реагента на культуру клеток.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа, который позволил бы при низких концентрациях реагента инактивировать инфекционную активность вируса иммунодефицита человека с сохранением антигенности и иммуногенности вирусных белков и других биологически активных веществ (иммуноглобулинов) с сохранением жизнеспособности и нормальной функции культур клеток человека или животных.

Указанная задача решается тем, что в способе ингибирования инфекционной активности вируса иммунодефицита человека, включающем обработку ВИЧ-содержащей суспензии культур клеток человека или животных этанолом с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре, согласно изобретению обработку этанолом проводят в конечных концентрациях, достаточных для потери инфекционной активности вируса иммунодефицита человека не менее чем на 1 lg и не влияющих на жизнеспособность и нормальную функцию культур клеток человека или животных.

Конечная концентрация этанола в ВИЧ-содержащей суспензии культур клеток человека или животных составляет (1,0 - 7,0)%.

Для получения антигена вируса иммунодефицита человека обработку ВИЧ-содержащей суспензии проводят не менее 30 минут.

Инактивация ВИЧ-1 инфекции основана на вирулицидном и антивирусном действии этанола.

При конечной концентрации этанола 10% и более наблюдается его токсическое действие на лимфоидные клетки, а при конечной концентрации менее 1,0% отмечается снижение инактивирующих свойств этанола.

Способ ингибирования инфекционной активности ВИЧ-1 осуществляют следующим образом.

Пример 1. Оценка токсического действия этанола на биологические объекты из периферической крови человека.

Вначале выделяют лимфоциты по методике Boyom (1966) и подсчитывают по обычной методике в камере Горяева. Далее клетки суспензируют в питательной среде RPMI-1640 с 15% сыворотки плода коровы, 2мМ L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина, 160 мкг/мл гентамицина. После чего клеточную суспензию с концентрацией 1 млн. клеток в 1 мл разливают в 24-х луночные культуральные планшеты фирмы "Costar" (Нидерланды) с последующим введением туда различных конечных концентраций медицинского этанола. Диапазон концентраций составляет (20-1,25)%. Клеточную суспензию инкубируют при 37 градусах C, в увлажненной атмосфере (95%) с 5% CO₂, отмечают ее состояние в течение 96 часов путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе "Diavert" (Германия) и подсчитывают количество клеток в каждой лунке с определением жизнеспособности клеток по обычной методике (окраска 0,04% раствором трипанового синего). Полученные результаты приведены в табл. 1.

Как видно из таблицы 1, препарат этанола оказывал токсическое воздействие на жизнеспособность лимфоцитов человека в концентрации 20% и 10%, в то время как концентрации 5%, 2,5% и 1,25% не оказывали токсического воздействия на клетки человека.

Пример 2. Оценка ингибирующей активности этанола (конечная концентрация 2,5% и 5,0%) на штамм ВИЧ-1 в течение 10 минут.

Исследования проводились на штамме ВИЧ-1 путем инкубации нетоксичных конечных концентраций (5% и 2,5%) равных объемов этанола и исходной концентрации вируссодержащей суспензии-ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого готовят десятикратные разведения вирусосодержащей суспензии в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2мМ L- глутамина, 100 мкг/мл канамицина, 160 мкг/мл гентамицина, вносят в пермессивную лимфобластоидную культуру клеток человека МТ-4, рассеченную в 96-луночные культуральные планшеты фирмы "Costar" в объеме 200 мкл с концентрацией клеток 1 млн/мл. Клеточную суспензию инкубируют при температуре 37^oC, во влажной атмосфере (95%) с 5% CO₂ и проводят титрование инфекционности ВИЧ-1 на культуре перевиваемых лимфобластоидных клеток человека МТ-4. Наблюдение проводят ежедневно путем микроскопии лунок планшета под инвертированным микроскопом "Diavert" с регистрацией процесса кластерообразования, жизнеспособности клеток и приготовлением мазков клеток на предметном обезжиренном стекле с целью определения количества инфицированных клеток МТ-4 в реакции непрямой иммунофлуоресценции (НИФ). Мазки клеток после высушивания фиксируют в растворе охлажденного до минус 20 градусов C ацетона в течение 12 ч. Затем их обрабатывают рабочими разведениями сывороток, содержащих специфические антитела к ВИЧ-1 (1:100) и контрольных в течение 30 мин во влажной камере при температуре 37 градусов С. После чего их трижды отмывают в физиологическом растворе и окрашивают кроличьими антителами против иммуноглобулинов человека, меченными ФИТЦ в разведении 1:32 в течение 20 мин во влажной камере при температуре 37 градусов С. На заключительном этапе мазки дважды промывают забуференным физиологическим раствором и ополаскивают дистиллированной водой, после чего проводят их микроскопию на флуоресцентном микроскопе "Axioskop" фирмы Opton (Германия), определяя процент инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 и интенсивность флуоресцентного свечения инфицированных клеток. Полученные данные при 10-минутной экспозиции этанола с ВИЧ-1 приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, этанол в обеих концентрациях (5% и 2,5%) при 10-минутной обработке ВИЧ-1 ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg и приводит к снижению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток во всех тестированных разведениях, со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток.

Пример 3. Оценка ингибирующей активности этанола (конечная концентрация 5% и 2,5%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 20 минут приведена в табл. 3. Методика проведения исследований описана в примере 2.

Как видно из табл. 3, этанол в концентрации 5% при 20-минутной обработке ВИЧ-1 ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg и приводит к снижению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток во всех тестированных разведениях по сравнению с контрольной культурой клеток МТ-4 инфицированной ВИЧ-1, со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток во всех разведениях вируса. Отмечается значительное увеличение способности к кластерообразованию инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 почти до уровня (100%) неинфицированного контроля клеток МТ-4 во всех исследуемых концентрациях ВИЧ-1.

Пример 4. Оценка ингибирующей активности этанола (концентраций 5% и 2,5%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 30 минут приведена в табл. 4. Методика проведения исследований описана в примере 2.

Как видно из табл. 4, при 30-минутной обработке ВИЧ-содержащей суспензии этанолом в конечной концентрации (5% и 2,5%) происходит значительное изменение инфицирующих свойств вируса, поскольку кластерообразование инфицированных клеток МТ-4 сохранялось во всех исследованных разведениях вируса на уровне неинфицированного контроля клеток. Кроме того, этанол полностью ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 2 lg и приводит к значительному уменьшению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток в оставшихся более концентрированных разведениях ВИЧ-1 (10^-1 и 10^-2) до 5-20%. При этом снижается интенсивность флуоресцентного свечения инфицированных клеток МТ-4, а следовательно, и степень репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в них.

Пример 5. Оценка ингибирующей активности этанола (конечные концентрации 2,5% и 1,0%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 60 минут приведена в табл. 5. Методика проведения исследований описана в примере 2.

Как видно из табл. 5, при 60-минутной обработке ВИЧ-инфицированных клеток этанолом в конечных концентрациях (2,5% и 1,0%) наблюдается изменение инфицирующих свойств вируса, поскольку кластерообразование инфицированных клеток в основном сохраняется во всех исследованных разведениях вируса на уровне неинфицированного контроля клеток, а также отмечается снижение процента светящихся в НИФ инфицированных клеток МТ-4. При этом этанол полностью инактивирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток МТ-4, а следовательно, и степени репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в них.

Экспериментальные исследования показывают, что при конечной концентрации этанола 10% и более наблюдается его токсическое действие на лимфоидные клетки, а при конечной концентрации менее 1,0% отмечается снижение инактивирующих свойств этанола. Причем установлено, что при повторной или многократной обработке культуры клеток этанолом в концентрациях (1-7%) не чаще чем через 3 часа после предыдущей обработки и длительности курса 1 сутки приводит к усилению инактивирующего действия препарата на ВИЧ-инфекцию без появления токсического эффекта на тестируемую культуру клеток.

Изобретение предназначено для инактивации вируса иммунодефицита человека 1-го типа в биологических материалах. Способ позволяет при низких концентрациях реагента инактивировать инфекционную активность вируса, но сохраняет антигенность и иммуногенность вирусных белков, жизнеспособность культур клеток человека и животных. Способ включает обработку вируссодержащей суспензии культур человека или животных этанолом с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре. Способ предполагается применять в медицине. 2 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ ингибирования инфекционной активности вируса иммунодефицита человека, включающий обработку вируссодержащей суспензии культур клеток человека или животных этанолом с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре, отличающийся тем, что обработку этанолом проводят в конечных концентрациях, достаточных для потери инфекционной активности вируса иммунодефицита человека не менее чем на 1 lg и не влияющих на жизнеспособность и нормальную функцию культур клеток человека или животных. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола в ВИЧ-содержащей суспензии культур клеток человека или животных составляет 1,0 - 7,0%. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку этанолом вируссодержащей суспензии культур клеток человека или животных проводят в течение 10 - 30 мин.