Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека 1 типа Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 A61K39/21 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии, в частности к культивированию вирусов, а именно к разработке высокоэффективного способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), пригодного для. использования в диагностических тест-системах, в частности иммуноферментной, иммуноблотинге, а также для получения инфекционного вируса, иммунизации лабораторных животных и др.

Известен способ получения антигенов LAV, основанный на культивировании уникальной культуры- продуцента вируса, сконструированной на основе перевиваемых Т-4 лимфоцитов человека с помощью сортера клеток, в результате чего была получена культура, максимально обогащенная клетками, имеющими сайты связывания, специфичные для вируса LAV.

Однако второй этап получения антигенов вируса остается традиционным - очистка вируса с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения антигенов ретро- вируса HTLV-III при культивировании Т-клеточной линии лимфоцитов человека НТ. штамм H9/HTLV-IIIB. который селектирован по фенотипу зрелых Т-лимфоцитов: ОКТЗ+(62%); ОКТ4 (39%): ОКТ8 . и может в течение длительного срока продуцировать вирус HTLV-MI (ВИЧ-1). Фирмы Du Pont. Abbot (США) и Wellcome (Великобритания) используют для тест-систем высокоочищенный антиген ВИЧ-1, получаемый при культивировании штамма-продуцента

H9/HTLV-IIIB.

Однако известный способ требует культивирования инфицированных клеток в

VJ

О CJ

больших объемах, что резко повышает риск инфицирования работающих и требует создания условий с высоким уровнем защиты. Последующая очистка вируса связана с ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это трудоемкая процедура, требующая высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования.

Недостатком известного способа является низкая стабильность при культивировании используемого штамма-продуцента, который требует периодического подсева неинфицированных клеток, что приводит к риску вытеснения из культуры продуцирующих ВИЧ-1 клеток неинфицированными, а также длительность процесса: по данным иммунофлюоресценции на 6-е сутки культивирования доля вируспродуцирующих клеток составляет 32% и только на 14-е сутки достигает 97%. При определении активности обратной транскриптазы (за активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки в импульсах в 1 мл культуральной жидкости) для штамма H9/HTLV-IHB даже к 14-м суткам культиви- робсоия включение метки не превышает 4,1xVO имп/мл.

Целью изобретения является ускорение способа, повышение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала.

Поставленная цель достигается использованием обогатительного пассажа на перевиваемых лимфоцитах человека линии МТ-4, которые обеспечивают продуктивный тип инфекции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Клетки штамма-продуцента ВИЧ-1 (штамм ГКВ № 4005) сокультивируют с клетками перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4 в соотношении 1:1-1:9 (обогатительный пассаж). Через 4-5 сут культивирования суспензию клеток центрифугируют и культ-уральной жидкостью инфицируют клетки МТ-4. После 4 сут культивирования инфицированные клетки МТ-4 осаждают центрифугированием, обрабатывают лизирующим буфером и инакти- вируют инфекционный вирус. Полученный таким образом лизат клеток может быть использован в ка естве антигена в диагностических тест-системах, в частности таких, как иммуноферментная и иммуноблотинг.

Пример 1. Сокультивирование клеток МТ-4 с клетками-продуцентами ВИЧ-1.

В роллеоную бутыль, содержащую (4,8-5,4)-10 клеток МТ-4 приливают (4.8-5,4)-108 клеток посевной культуры ГКВ

N 4005 (т.е. соотношение клеток МТ-4 и клеток-продуцентов ВИЧ-1 составляет 1:1). Примеры использования других соотношений клеток в обогатительном пассаже приводятся в табл, 1. Содержимое роллерной бутыли тщательно перемешивают и разливают по (3,2-3,6)-10 клеток в стерильные роллерные бутыли, В каждую бутыль доливают ростовую питательную среду по

300 ± 10 мл. Питательную среду для культивирования готовят следующим образом. К 415 ±20 мл питательной среды RPM1-1640 приливают 75 ± 10 мл сыворотки плода коровы, 10 ± 1 мл 3%-ного раствора «-глутамина, 1,0 ±0,1 мл 30%-ного раствора линкомицина(или канамицина 100 мкг/мл), 8,0 ± 10 мг гентамицина. Засеянные роллерные бутыли инкубируют при 36-37°С и частоте вращения 1-2 об/мин в течение

4-5 сут.-.,.

По окончании инкубации контролируют

уровень вируспредукции иммуноферментным методом. Подготовку образцов для

ИФА осуществляют, инактивируя ВИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией при 6 ±2°С не менее 24 ч. Из приготовленных таким образом.лрюб готовят ряд последовател §гдегукратных разведений, которые затем вносят попарно по 100 ± 1 мкл в лунки сенсибилизированных планшетов тест-системы Вектор или Abbott. Дальнейшие операции и учет результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. За титр вирусного антигена принимают то конечное разведение исходного материала, в котором достоверно выявлялся антиген ВИЧ-1 (табл. 1),

П р и м е р 2. Получение лизата инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4.

Посевной ВИЧ-1 для заражения клеток МТ-4 получают следующим образом. На 4- 5-е сутки сокультивирования (пример 1) содержимое роллёрных бутылей переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 4 ± 2 С, частоте вращения 5000 об/мин (4000 д) в течение 10 мин. Полученный су- пернатант используют далее в качестве посевного ВИЧ-1.

В роллерную бутыль, содержащую (2,6-2,7) 109 клеток МТ-4, приливают 520 ±20 мл посевного ВИЧ-1, содержимое бутыли тщательно перемешивают и инкубируют при 36-37°С не менее 1 ч (адсорбция ВИЧ-1 на клетках МТ-4). По окончании адсорбции суспензию инфицированных клеток рассеивают в роллерные бутыли по 2,0 ±0,1 Й108 клеток в бутыль, доливают ростовую питательную среду (как в примере 1) до конечного объема 400 ±20 мл. Засеянные роллеры инкубируют на роллерной установке при Зб-37°С и частоте вращения 1-2 об/мин в течение 96 ± 5 ч.

По окончании культивирования отбирают пробы культуральной жидкости и клеток и определяют в них титр антигена ВИЧ-1 методом иммуноферментного анализа (по примеру 1), а также оценивают долю вирус- предуцирующих клеток (ВПК) методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) с сывороткой крови, содержащей антитела к ВИЧ-1. Кроме того, уровень вируспродук- ции оценивают по активности обратной трэнскриптазы (табл. 2).

За активность обратной транскрипта- зы принимают включение радиоактивной, метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости. Культуру клеток МТ-4, инфицированную ВИЧт1, переносят в центрифужные стаканы и промывают охлажденным до 6 ± 2°С физиологическим раствором (рН 7,4). Осадок промытых клеток ресуспенди- руют в физиологическом растворе до концентрации (2 ±0,2)-108 кл/мл v добавляют равный объем лизирующего буфера, охлажденного до (6 ±2)°С.

Лизйрующий буфер готовят следующим образом.

Навеску трис (0,12 ±0,01 г) растворяют 1 90 мл физиологического раствора, с помощью соляной кислоты доводят рН до 7,6 ±0,1. К полученному раствору прибавляют 1,0 ±0,1 мл тритона х-100, навески 0.05 ±0,01 г азида натрия, 0,01 ±0,001 г ингибитора трипсина (фирмы Sigma) и 0,02 ±0,001 г фенилметилсульфонилфлуо- рида той же фирмы. После полного растворения объем доводят до 100 мл.

После 10-минутной инкубации при 6 ± 2°С лизированные клетки переносят в центрифужные пробирки вместимостью 45 мл, уравновешивают и центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 12000

10

5

0

5

0

5

0

5

об/мин и температуре 6 ± 2°С (центрифуга L-8, Beckman. ротор JA-20). Осадок отбрасывают, а к супернатанту приливают этиленимин до конечной концентрации 0,1-0,01%, Лизат клеток замораживают, оттаивают, приливают равный объем буферного раствора А, перемешивают и центрифугируют в роторе JA-20 при частоте вращения 18000 об/мин и температуре 6 ± 2°С в течение 15 мин.

Буферный раствор А готовят следующим образом. Навеску трис 0,6 ± 0.05 г растворяют в 90 мл физиологического раствора, доводя рН до 7,4 ±0,1. К полученному раствору прибавляют навески 0,03 ± 0,003 г ЭДТА, 0,1 ±0,01 г дезоксихолата натрия, 0,1 ±0,01 г додецилсульфата натрия и 1,0 ±0,1 мл тритона х-100. После полного растворения объем раствора доводят до 100мл.

Предлагаемый способ получения антигена ВИЧ-1 позволяет выделять полноценный вирусный антиген, содержащий полный набор вирусспецифических белков. Кроме того, потери вирусных белков при получении антигена составляют не более 20-30%.

Формула изобретения Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека I типа, включающий культивирование инфицированных клеток на стандартной питательной среде с последующим получением вирусного антигена, отличающийся тем. что, с целью ускорения способа, повышения выхода антигена и снижения риска инфицирования работающего персонала, из клеток используют лимфоидные клетки МТ-4. их инфицирование проводят культуральной жидкостью, полученной в результате совместного культивирования клеток МТ-4 с перевиваемыми моноцитами человека штамма ГКВ № 4005, взятых в соотношении 1 :(1 -9) в течение 4-5 сут, а антиген готовят через 4 сут культивирования лизированием клеток.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение относится к вирусологии, а именно к разработке высокоэффективного способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Цель - ускорение способа, увеличение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала. Клетки штамма ГКВ N 4005 (перевиваемые моноциты человека, хронически инфицированные ВИЧ-1) сокультивируют с перевиваемыми лимфоцитами человека линии МТ-4 в соотношении 1:(1-9). Через 4-5 сут культивирования клетки осаждают и полученной культуральной жидкостью инфицируют клетки МТ-4. На 4-е сутки культивирования инфицированные клетки МТ-4 осаждают центрифугированием, обрабатывают лизи- рующим буферным раствором и инэктиви- руют инфекционный вирус. 2 табл. сл С