ШТАММ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1-ГО ТИПА ИВ710 СУБТИПА А РЕЗИСТЕНТНЫЙ К АНТИРЕТРОВИРУСНЫМ ПРЕПАРАТАМ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 G01N33/569 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

С появлением антиретровирусной терапии (АРВ-терапия) ВИЧ-инфекция стала не фатальным, но хроническим заболеванием. Однако от 50 до 70% пациентов, получавших АРВ-терапию, не чувствительны к действию антиретровирусных лекарств [1]. В настоящее время возрастает количество сообщений о появлении новых штаммов, резистентных к действию антиретровирусных препаратов, несмотря на попытки по предотвращению их появления [2]. Одна из причин их появления - неоптимальная терапия антиретровирусными препаратами, поскольку ВИЧ-инфекция характеризуется экстремальной генетической дивергентностью вирусной популяции. Варианты вирусов постоянно эволюционируют и способны уклоняться от иммунного ответа хозяина, приобретая измененный клеточный тропизм и представляя лекарственно устойчивые варианты. При этом гетерогенность ВИЧ-1 популяции в инфицированном индивидууме может неравномерно распределяться внутри организма [3]. В настоящее время практически все данные по резистентности штаммов ВИЧ-1 получены на субтипе вируса В, циркулирующем в странах Западной Европы, Северной Америки и Австралии [4]. Информация же по субтипу А, преобладающему на большей части территории РФ и территории бывших советских республик [5, 6], фактически отсутствует. В связи с этим особую важность для изучения химиопрепаратов нового поколения и создания вакцинных препаратов приобретает применение штаммов вируса, которые принадлежат к субтипу, эндемичному для территории РФ.

Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу А и резистентного к антивирусному действию химиопрепаратов класса нуклеозидных аналогов, ненуклеозидных аналогов и ингибиторов протеазы, широко применяющихся в лечении ВИЧ-инфекции.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВУ 10 субтипа А, резистентный к антиретровирусным препаратам (АРВ-препараты), для диагностических и вакцинных препаратов хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188 от 16.01.12 и имеющий нуклеотидную последовательность гена pol, приведенную на фигуре 1.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИДом. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция

Штамм ВИЧ-1 ИВ710 реплицируется в лимфоцитах периферической крови, а также в лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитиобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИДом [7]. Продуктивная активность штамма составляет 3,5-4,0 lg ТЦД50 (таблица 1). Более низкий инфекционный титр штамма ИВ710 по сравнению со штаммом-аналогом объясняется тем, что штамм LAV был выделен от больного, не получавшего АРВ-терапию.

Антигенные свойства

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюресценция. Исследование штамма ИВ710 методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИДом, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 30-35% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте штамма ИВ710 показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41,31, 24,17 кД (таблица 2).

Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном ро1, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC), подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу А.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ710.

Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в Таблице 1.

Установлено, что титр штамма ИВ 710 составляет 3,5-4,0 lg ТЦД 50 (цитотоксических доз), что является довольно высоким титром, учитывая, что вирус выделен от больного, получавшего АРВ-терапию. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Пример 2. Диагностика антител к белкам ВИЧ-1 методом иммуноблота. Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 8 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащими анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВУ 10 и штамм-аналог ВИЧ-1 LAV.

Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип) с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1 фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин), и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-Т вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.

Результаты исследований представлены в Таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ710 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.

Пример 3. Исследование наличия резистентности к химиопрепаратам класса нуклеозидных, ненуклеозидных аналогов и ингибиторов протеазы.

Для проверки отсутствия противовирусного действия препаратов были взяты азитотимидин и эпивир (нуклеозидные аналоги, ингибирующие действие обратной транскриптазы), вирамун (ненуклеозидный аналог, ингибирующий действие обратной транскриптазы) и криксиван (ингибитор протеазы) в максимальной концентрации 20 мкг/мл. В качестве вирусного контроля был взят штамм-аналог ВИЧ-1 LAV. Противовирусное действие препарата оценивалось по жизнеспособности лимфобластоидных клеток человека (Таблица 3) и по уровню антигена вируса (р24) в культуральной жидкости (Таблица 4). Исследование противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Далее смена среды производилась на 2-3 день культивирования. При смене среды старая среда полностью удалялась, клетки отмывались свежей средой RPMI-1640 без сыворотки, после чего добавлялась свежая питательная среда (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим. Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм.

В результате проведенных исследований установлено, что при внесении в культуру клеток, инфицированных штаммом ИВ710, химиопрепаратов различного класса, не наблюдается противовирусного эффекта, что свидетельствует о лекарственной резистентности данного штамма. Следовательно, данный штамм может быть использован для изучения противовирусного действия химиопрепаратов нового поколения, а также для вакцинных препаратов.

Таблица 1 Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ710 на модели клеток МТ-4 и Jurkat Титр, lg ТЦД 50 Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток МТ-4) Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток Jurkat) LAV ИВ710 LAV ИВ710 6,0 3,5 6,0 4.0

Таблица 2 Исследование штамма ИВ710 методом иммуноблота Штамм Выявленные антитела Контроль (LAV) 160 120 65 55 41 31 24 17 ИВ710 160 120 65 55 41 31 24 17

Таблица 3 Сравнительное исследование противовирусной активности химиопрепаратов в культуре лимфобластоидных клеток человека, инфицированных штаммами ИВ710 и LAV по цитопатическому действию Контроль клеток Контроль вируса (LAV) ИВ710 AZT 20 мкг/мл Вирамун 20 мкг/мл Эпивир 20 мкг/мл Криксиван 20 мкг/мл 98^* 18 17 18 25 26 * - процент жизнеспособных клеток

Таблица 4 Сравнительное исследование противовирусной активности химиопрепаратов в культуре лимфобластоидных клеток человека, инфицированных штаммами ИВ710 и LAV методом иммуноферментного анализа Контроль клеток Контроль вируса (LAV) ИВ710 AZT 20 мкг/мл Вирамун 20 мкг/мл Эпивир 20 мкг/мл Криксиван 20 мкг/мл 0,098^* 1,988 1,393 1,394 1,399 1,331 * оптическая плотность

Источники информации

1. Hirsch M.S., Gunthard H.F., Schapiro J.M et al. Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008 recommendations of an international AIDS society-USA panel // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol.47. - P. 266-285.

2. Shafer R.W., Rhee S.Y., Bennett D.E. Consensus resistance mutations for epidemiological surveillance: basic principles and potential controversies // Antivir. Ther. - 2008. - Vol.13. - P. 59-68.

3. Choudhury В., Pillay D., Taylor S. P. Analysis of HIV-1 variation in blood and semen during treatment and treatment interruption // J. Med. Virol. - 2002. - Vol.68. - P. 467-472.

4. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.51. - P. 229-240.

5. Bobkov A.F., Kazennova E.V., Selimova L.M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. - 2004. - V.74. - P.191-196.

6. Nosik M., Ryzhov К., Kravtchenko A. et al. Genotypic Analyses of HIV in antiretroviral drug-naive patients from Moscow and Moscow Region, Russia// 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 17-20 July 2011, Rome, Italy, Abs.CDA002.

7. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188. Штамм обладает стабильной репродуктивной активностью. Инфекционный титр составляет 3,5-4,0 lg ТЦД 50. Штамм является моделью для изучения антивирусной активности химиопрепаратов нового поколения, а также для создания вакцинных препаратов. 1 ил., 4 табл., 3 пр.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 субтипа А, резистентный к антиретровирусным препаратам, для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188 и имеющий нуклеотидную последовательность гена pol, приведенную на фигуре 1.