СПОСОБ РАННЕЙ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ И БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области физиологии и медицины, более конкретно, к онкологии и неврологии и может быть использовано для ранней молекулярно-биологической диагностики рака, других злокачественных новообразований (ЗНО) и бокового амиотрофического склероза (БАС).

В настоящее время определенные формы рака (рак легких, рак печени и т.д.) и других злокачественных новообразований (некоторые гемабластозы, мультиформная глиобластома, меланома, миеломная болезнь, лимфома и др.) неизлечимы и фатальны. Отсутствуют лечение и возможность предотвращения быстрого летального исхода при диагностике БАС. Время жизни пациентов с установленными диагнозами некурабельного рака, ряда неизлечимых ЗНО и БАС составляет 1-3 года. До 5 лет и более с этими диагнозами доживают не более 10-15% больных. Диагностика этих фатальных заболеваний крайне затруднена и часто запаздывает, а установленный диагноз это уже «приговор без права на помилование».

Злокачественные опухоли и БАС это две крайние точки две крайние противоположности среди всех смертельных болезней человечества. БАС это заболевание, которое сопровождающееся массивной нейродегенерацией передних рогов спинного мозга, гипотрофией и атрофией мышц туловища и конечностей, то есть формированием синдромов «минус ткань» в организме, а ЗНО сопровождаются пролиферацией, отеком ткани, разрастанием и миграцией клеток и формированием в организме синдрома «плюс-ткань». Поэтому авторы настоящего изобретения предположили, что сравнительный анализ этих двух противоположных патологических феноменов абсолютно разных смертельных болезней может дать ключ к решению проблемы их ранней диагностики и диагностики других малокурабельных нейродегенеративных заболеваний нервной системы (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, оливопонтоцеребеллярная дегенерация, системные корковые и мозжечковые атрофии и т.д.).

Показано, что ранняя диагностика любого неизлечимого заболевания у человека дает ему определенный шанс на увеличение продолжительности жизни и последующего выживания в результате своевременно начатого лечения. В современной онкологии существует ранняя молекулярно-биологическая диагностика рака и других ЗНО, которая основана на выявлении молекул онкоспецифических белков (так называемых онкомаркеров) в биологических жидкостях пациента (кровь, моча, ликвор и т.д.). Онкомаркеры позволяют выявить у человека рак и ЗНО на 1-2 стадии и после адекватного и своевременного лечения обеспечить ему пятилетнюю медиану выживаемости. Показано, что показатели выживаемости от рака увеличиваются в 2-3 раза именно при ранней диагностике ЗНО с использованием онкомаркеров в виде онкоспецифических белков и способствуют увеличению медианы выживаемости раковых больных в 2-3 раза, а в ряде случаев способствует и полному выздоровлению больных (Давыдов М.И. с соавт., 2017). Современные критерии ранней диагностики рака и ЗНО позволяют диагностировать канцерогенный процесс тогда, когда он уже получил определенную канцерогенную тканеспецифичность, что зачастую бывает достаточно поздно, и рак при минимальном первичном очаге и высокой злокачественности уже дал множественные отдаленные метастазы. Обнаружение онкомаркеров позволяет заподозрить наличие опухоли в организме на относительно ранней стадии, проводить масштабные скрининговые исследования и отслеживать динамику болезни в процессе лечения. При выявлении в процессе скрининга повышенного уровня одного из онкомаркеров требуется проведение дополнительных методов исследования, без которых постановка диагноза неправомочна.

В настоящее время диагноз БАС устанавливают только клинически и по данным электронейромиографии, когда больного спасти практически невозможно и у него осталось не более 10-15% мотонейронов в нервной ткани. Ранней молекулярно-биологической диагноста БАС и его реального лечения до сих пор не существует. И если для ранней диагностики рака уже были найдены ранние онкомаркеры заболевания, то для БАС их просто не существует, и в этой связи, прогноз при диагнозе БАС звучит более трагичней прогноза при диагностике рака или других ЗНО. Определенные формы рака имеют шансы на излечение, а БАС в современном его понимании - нет. Онкомаркеры это онкоспецифические белки, появляющиеся в цитоплазме опухолевой клетки (ОК) в результате 4-5 генетических мутаций ее генома. При БАС также описаны в цитоплазме мотонейронов целый спектр патологических белков, возникающих в результате мутаций ряда генов, таких как SOD1, FUS, TD43 и других. Но обнаружение их молекул в крови не позволяет диагностировать БАС.

Ранее было показано в эксперименте, что у всех онкологических пациентов ОСК имеют изменения протеомной структуры клетки на уровне белков клеточной мембран, цитоплазматических и ядерных белков (Брюховецкий А.С., 2014; Брюховецкий И.С., Шевченко В.Е., 2017). Однако протеомное картирование ГСК и профилирование белков кроветворных клеток путем проведения классической масс-спектрометрии ГСК для выявления всего спектра онкоспецифических изменений в этих клетках является крайне дорогостоящими и длительными исследованиями и применяются только в научно-исследовательских работах. Поэтому они практически не могут широко применяться к клинике и быть рабочими маркерами ранней диагностики рака.

Известен способ диагностики рака желудка на ранней стадии, а именно способ определения риска развития рака желудка или карциномы in situ, включающий взятие у пациента образцов, которые включают клетки слизистой желудка или предраковых повреждений при карциноме желудка, и определение в образцах экспрессию мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОКС-2) или белка ЦОКС-2, причем высокие уровни экспрессии по сравнению с контрольными образцами указывают на повышенный риск развития рака желудка (патент RU 2204835, 2001, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68).

Известен также способ ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы, заключающийся в том, что исследуют сыворотку крови на метилирование промоторных районов генов GSTP, р16 и N33 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы двух из указанных генов делают вывод о наличии заболевания (патент RU 2405837, 2010, МПК C12Q 1/68).

Оба известных способа, хотя и относятся к способам ранней диагностики рака, осуществляются на той стадии развития онкологических процессов в организме, когда уже имеются признаки тканеспецифической принадлежности ракового новообразования.

Целью настоящего изобретения является обеспечение способа диагностирования ЗНО или БАС на самой ранней стадии заболевания. Технический результат изобретения заключается в использовании простой и надежной системы критериев ранней диагностики еще до формирования соответственно тканеспецифической принадлежности ракового новообразования или наличия клинических и нейрофизиологических проявлений нейродегенерации у обследуемого субъекта.

Указанная цель с достижением указанного технического результата достигается тем, что предложен способ ранней молекулярно-биологической иммуноспецифической диагностики злокачественных заболеваний (ЗНО) и/или бокового амиотрофического склероза (БАС), включающий в себя иммунофенотипирование мембранных антигенов (CD-маркеров) гемопоэтической (CD34+ CD45+ HLA DR+) стволовой клетки (ГСК) обследуемого субъекта с последующим картированием и профилированием основных белковых маркеров мембранной поверхности (БММП) ГСК этого субъекта и сравнительный анализ показателей экспрессии белков полученного профиля (исследуемого профиля) с аналогичными параметрами протеомного профиля БММП ГСК (нормального профиля), установленного для статистически значимой группы здоровых доноров костного мозга, причем, если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают различия между ними в экспрессии шести и более CD-маркеров, то диагностируют противоопухолевую и/или связанную с БАС нейродегенеративную недостаточность иммунной системы (НИС) у обследуемого субъекта вне зависимости от наступления тканевой специфичности опухоли или наличия у него клинических и нейрофизиологических проявлений нейродегенерации соответственно.

При этом протеомные профили БММП ГСК получают преимущественно методом мультицветной проточной цитофлюориметрии в гейте CD34+ CD45+ ГСК со стандартными специфическими антителами к мембранным антигенам.

Кроме того, согласно настоящему изобретению ГСК получают преимущественно из эксфузата костного мозга обследуемого субъекта или из его периферической крови, мобилизованной стимуляцией гранулоцитарным или гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором и взятой у обследуемого субъекта из любого венозного доступа.

Далее, согласно настоящему изобретению, если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гиперэкспрессию CD81+ маркера и гипоэкспрессию CD 38+, CD33+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD28+, CD300+ и CD2+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют онкоспецифический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта, свидетельствующий о наличии у него чрезмерного количества опухолевых клеток вне зависимости от наступления тканевой специфичности опухоли.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гипоэкспрессию HLA DR+, CD38+, CD13+, CD71+, CD117+, CD90+, CD50+, CD19+ маркеров и гиперэкспрессию CD56+, CD61+, CD2+, CD7+ и CD81+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют БАС-специфический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта вне зависимости от наличия у него клинических и нейрофизиологических проявлений нейродегенерации. При этом у родственников больных БАС с диагностированным БАС-специфическим профилем БММП ГСК диагностируют наличие семейной формы заболевания.

Роль иммунной системы в развитии рака почти всех ЗНО и БАС принципиальна, хотя во многом неоднозначна и преимущественно негативна. Очевидно, что во всех случаях этих смертельных заболеваний имеет место избирательная функциональная НИС, которая играет важное значение в патогенезе и патоморфологии этих заболеваний. Так, при большинстве запущенных форм рака и ЗНО с распространенными метастазами иммунная система пациента никак не реагирует на генерализацию опухолевого процесса и наличие у больного первичных огромных опухолевых узлов и распространенных метастатических новообразований. ОК легко уклоняются от уничтожения натуральными киллерами врожденного иммунитета и от цитотоксических Т-клеток приобретенного иммунитета, и эти механизмы подробно описаны учеными. При этом избирательно нарушается только противоопухолевая функция иммунитета, а все другие функции иммунитета (противомикробная, противовирусная, противогрибковая, борьба с простейшими и т.д.) практически не страдают. Иммунный статус у этих онкобольных соответствует показателям нормы или близок к ней. Аналогичная ситуация с иммунной системой происходит и при БАС. Несмотря на то, что долгое время заболевание считали аутоиммунным, существенных количественных изменений клеточного и гуморального иммунитета при БАС не выявлено. Более того, в последние годы неврологи во всем мире считали аутоиммунный генез БАС вообще необоснованным, так как нет эффекта от применения стандартной терапии при аутоиммунных заболеваниях: нет достижения ремиссии болезни при терапии глюкокортикоидными гормонами, нет эффекта от аутологичной трансплантации костного мозга при рассеянном склерозе и других аутоиммунных болезнях соединительной ткани, нет результата от применения плазмофереза и нет результатов от применения блокаторов интерлейкинов и других препаратов, направленных на уменьшение системного воспаления и деструкции ткани.

Однотипность иммунологических реакций организма при этих двух полярных заболеваниях позволяет допустить схожесть патогенетических механизмов их развития с определенными вариациями и особенностями их морфологического дефекта в клетках иммунной системы. Оба этих заболевания имеют в своей основе доказанный генетический дефект и статистически достоверные транскриптомные и протеомные нарушения. Это позволило предположить, что в основе молекулярно-биологического дефекта этих двух заболеваний лежит повреждение ГСК как родоначальниц всех клеток системы кроветворения и иммунитета у человека. ГСК - очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровням дифференцировки и способности к пролиферации. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественники. Концентрация СК в периферической крови в состоянии стабильного кроветворения мала, менее 0,01%, что делает затруднительным их изучение даже самыми чувствительными методами (Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н., 2017). Но именно ГСК имеют самый большой клеточный цикл среди всех клеток организма человека (360 дней), являются основной регуляторной и управляющей системой в существующей иерархии всех клеточных систем организма, первыми реагируют на мутации генов в клетках и появление асептического воспаления в патологических тканях и органов, мигрируют туда на градиент концентрации воспаления из костного мозга, адгезируют к патологическим клеткам и направляют их развитие в сторону дифференцировки или апоптоза по механизму bystander effect. ГСК в зоне воспаления осуществляют горизонтальный и вертикальный информационный обмен цитоплазматическими белками с патологическими клетками. Эти факты были изучены и опубликованы ранее в научной литературе (Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Брюховецкий А.С., Толок Е.В. Взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro // Тихоокеанский медицинский журнал №4, 2014, с. 31-37, 2014; Милькина Е.В., Мищенко П.В., Зайцев СВ., Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Брюховецкий А.С, Хотимченко Ю.С.Особенности взаимодействия между гемопоэтическими стволовыми и опухолевыми клетками различных линий in vitro // журнал «Гены & клетки». Том XI, №3, 2016, с. 63-71, 2016) и они представляют собой универсальный механизм формирования патоспецифического протеома в ГСК. В зависимости от мутационного повреждения клеток-мишеней в тканях ГСК происходит геномно-протеомное повреждение ГСК и формирование из них опухолевых стволовых клеток (ОСК) или клеток, получивших вакцинацию иммуноспецифическими белками, что было показано в исследованиях по онкопротеомике СК (Брюховецкий А.С., 2014).

Поэтому в процессе создания настоящего изобретения были прицельно изучены и выявлены патологическая специфика протеомных профилей белковых маркеров клеточной поверхности ГСК при раке, других ЗНО, а также БАС, что имело большое значение для выявления уникальных иммуноспецифических характеристик молекулярного ландшафта клеточной поверхности ГСК как фундаментальных молекулярно-биологических критериев для ранней диагностики этих неизлечимых заболеваний.

На фиг. 1 представлена диаграммы протеомного профиля маркеров клеточной поверхности ГСК у онкологических больных (детей и взрослых) и здоровых доноров;

на фиг. 2 - диаграммы протеомного профиля маркеров клеточной поверхности ГСК у 15-ти больных БАС, 150-ти онкологических больных и 50-ти здоровых доноров;

на фиг. 3 - диаграммы иммунофенотипического профиля белковых мембранных маркеров ГСК при семейном БАС (у донора - здоровой старшей сестры больной и больной БАС, младшей сестры) и здоровых доноров (норма);

на фиг. 4 - диаграммы иммунофенотипического профиля при спорадическом БАС (у отдельных больных и усредненный профиль при БАС) и в норме;

на фиг. 5 - профили белковых маркеров мембранной поверхности ГСК в норме (пробы 1-2), при травме спинного мозга пробы 3-5, 7), при БАС (проба 6) и при раке легких (проба 8).

Для реализации настоящего изобретения у каждого обследуемого донора костного мозга, онкологического больного или больного БАС под местной анестезией 0,5-1% раствора новокаина или лидекаина забирали путем тонкоигольной пункции грудины (стернальная пункция) или пункции подвздошной кости и эксфузировали 1-2 мл костного мозга или брали 2-3 мл лейкоконцентрата мобилизованных мононуклеаров периферической крови, полученных после стандартной процедуры лейкоцитофереза после мобилизации ГСК в периферическую кровь в течение 3-5 дней с применением гранулоцитарного (Г-КСФ) или гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). После взятия мобилизованной крови ее центрифугировали и удаляли эритроциты и гранулоциты. Очищенный лейкоконцентрат передавали в иммунологическую лабораторию и там с использованием стандартных антител (см. таблицу 1) на многоцветном цитофлюориметре типа FaxCan исследовали экспрессию 16-ти белковых мембранных маркеров ГСК (CD34+, CD45+, HLA DR+).

На основании проведенного цитофлюориметрического анализа описывали и профилировали состояние экспрессии основных маркеров клеточной (мембранной) поверхности (CD38, CD71, CD90, CD56, CD19, CD61, CD 117, CD10 и CD2) ГСК с получением протеомных профилей БММП ГСК у обследуемых субъектов и у здоровых доноров (исследуемые и нормальные профили соответственно) и проводили сравнительный анализ какого-либо исследуемого профиля с нормальным профилем, установленным для статистически значимой группы здоровых доноров. При установлении различий между исследуемым и нормальным профилями в экспрессии шести и более CD-маркеров диагностировали противоопухолевую и/или связанную с БАС нейродегенеративную НИС у обследуемого субъекта, даже если у него отсутствовала тканевой специфичность опухоли или не наблюдались клинических и нейрофизиологические проявления нейродегенерации.

Кроме того, если наряду с указанными различиями в экспрессии не менее шести CD-маркеров, устанавливали в том числе гиперэкспрессию CD81+ маркера и гипоэкспрессию CD 38+, CD33+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD28+, CD300+ и CD2+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностировали онкоспецифический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта, который свидетельствовал о повышенной степени НИС у обследуемого субъекта и о наличии у него чрезмерного количества ОК (более нормы, т.е. более 10⁵) также вне зависимости от наступления тканевой специфичности опухоли. Далее определяли прямые показания к проведению заместительной иммунотерапии.

Если наряду с вышеуказанными различиями в экспрессии не менее шести CD-маркеров устанавливали в том числе гипоэкспрессию HLA DR+, CD38+, CD 13+, CD71+, CD117+, CD90+, CD50+, CD19+ маркеров и гиперэкспрессию CD 56+, CD61+, CD2+, CD7+ и CD 81+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностировали БАС-специфический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта, характерный для повышенной степени НИС, также вне зависимости от наличия у него клинических и нейрофизиологических проявлений нейродегенерации.

Для проверки достоверности способа по настоящему изобретению были выполнены исследования БММП ГСК при различных ЗНО и БАС. Исследование субпопуляций ГСК было проведено на 569 образцах кроветворной ткани -клетках крови и клетках лейкоферезного продукта (ЛП) у 167 онкологических больных взрослого возраста и на 557 образцах кроветворной ткани у 263 больных онкопедиатрической клиники. В исследование включен 61 образец ЛП от 50 взрослых доноров аллогенной кроветворной ткани для 47 реципиентов (дети с онкогематологической патологией) и 86 образцов у 62 пациентов с БАС. Все больные получали лечение и наблюдались в отделениях трансплантации костного мозга онкогематологии и онкологии ФГБУ РОНЦ им Н.Н. Блохина и клинике «НейроВита» в период с 1996 года по 2018 год.

Проанализировано 179 образцов периферической крови и 390 образцов мононуклеарной фракции клеток крови ЛП, полученных в ходе процедуры сепарации периферической крови на сепараторах крови (Baxter, Cobe Spectra).

Средний возраст взрослых онкологических больных составил 33 года (медиана 32 года, от 16 до 64 лет), вес пациентов варьировал от 43 до 113 кг. Среди пациентов преобладали мужчины - 113 человек, женщины - 54 человека. Средний возраст пациентов с БАС составил 56 лет (медиана 54 года, от 42 до 68 лет). Среди пациентов с БАС доминировали мужчины (47 человек) над женщинами (15 человек). Средний вес пациентов с БАС составил 64,7 кг у мужчин и 56,4 кг у женщин.

В исследуемой группе взрослых преобладали больные с онкогематологической патологией (158 человек - 94,7% от общего числа больных): лимфома Ходжкина - 58 человек (34,7%), неходжкинские лимфомы (НХЛ), в том числе диффузная В-крупноклеточная лимфома и лимфомы из В-линейных предшественников, 2 пациента с лимфомой Бёркитта, - 57 человек (34,1%), В исследование включены 40 больных (23,9%) множественной миеломой и 3 больных острым миелоидным лейкозом. Незначительную долю составили больные с негемопоэтическими опухолями (всего 5,3%, 9 человек). Рак молочной железы - 3 больных, 2 больных мелкоклеточным раком легкого, 1 больной -негерминогенная опухоль яичек, 1 больной- герминогенная опухоль и 2 больных -саркома Юинга.

Среди всех 62 больных БАС 6 пациентов страдали семейной формой БАС, из которых у двух пациентов была диагностирована аутосомно-доминантная форма БАС, ассоциированная с мутациями СОД-1, а у одного пациента без мутации СОД-1. У трех пациентов был выявлен аутосомно-рецессивный семейный БАС, ассоциированный с мутациями СОД-1. У остальных 56 человек БАС был представлен спорадической формой. 6 больных БАС имели высокую (церебральную) форму, у 16 пациентов была бульбарная форма БАС, в 7 случаях отмечена шейно-грудная форма БАС, а 33 пациента имели пояснично-крестцовую форму. Одна пациентка за период наблюдения была переведена на аппарат искусственной вентиляции легких, но в дальнейшем, в течение двух лет продолжила свое пребывание в исследовательской группе, находясь на аппаратном дыхании.

Во всех случаях для мобилизации ГСК у взрослых использован Г-КСФ. Предлеченность у взрослых онкологических больных варьировала от 2 до 22 курсов химиотерапии. Химиотерапевтические режимы, предшествующие введению ростовых факторов, варьировали в зависимости от диагноза больного. Так, в случае лимфом Ходжкина и в нескольких случаях НХЛ использованы схемы DEXA-BEAM и ВЕАСОРР. В ряде случаев В-клеточных лимфом у взрослых использованы схемы с ритуксимабом (R-CHOP). При лимфоме Ходжкина также в нескольких случаях применены схемы CHOP. При множественной миеломе назначению ростовых факторов предшествовала схема VAD, при раке молочной железы - CAF.

Также были охарактеризованы ГСК в 557 образцах стимулированной кроветворной ткани (115 - периферийная кровь, 442 - ЛП) у 263 детей (123 девочки и 140 мальчиков). 48 больных находились на лечении по поводу рецидивной или резистентной к предыдущей химиотерапии нейробластомы, у 41 - другие мягкотканые саркомы (рабдомиосаркома - 14, синовиальная саркома - 7, ретинобластома высокого риска - 20), 24 человека - примитивные нейроэктодермальные опухоли, 63 - саркома Юинга высокого риска, у 22 - острый миелоидный лейкоз высокого риска, у 16 - лимфома Ходжкина, 6 - В-НХЛ, 11 больных - опухоли ЦНС (глиома, АТРО, эпиндимома), 28 больных медуллобластомой, 1 - метастатическая остеосаркома, 3 больных герминогенными опухолями. Средний возраст 7,88±0,28 лет (медиана 7 лет, от 0,6 до 19 лет), средний вес - 29,3±0,98 кг (медиана 23,0 кг, от 7,0 до 87,0). 95% лейкаферезов (420 из 442) проведены после мобилизационных режимов, включающих химиотерапию с последующим назначением одного из миелоцитокинов или их комбинации. Г-КСФ назначался у 259 больных, ГМ-КСФ - у 4 больных.

Средний возраст здоровых доноров костного мозга составил 37,6 лет (диапазон от 26 до 44). Среди доноров мужчины составили 35 человек, женщины - 15 человек. Средний вес доноров-мужчин составил 86 кг, а средний вес доноров-женщин - 76,6 кг.

Предлеченность больных с БАС была отмечена во всех случаях у пациентов с этим заболеванием. Как правило, все эти больные уже прошли все возможные курсы лечения в ведущих клиниках Москвы или в специализированных клиниках мира (пациенты из 10 стран мира) и попадали в экспериментальную группу в отчаянии от безысходности своего положения и при полном отказе в лечении в других лечебных учреждениях. У 5 больных ранее были проведены курсы различных типов клеточной терапии в России, Китае или Германии.

На момент начала лейкафереза у всех онкологических больных был достигнут положительный ответ (полная или частичная ремиссия) со стороны первичной опухоли и/или метастазов и в пунктате костного мозга метастазы опухоли микроскопически не выявлялись.

В ходе исследования 1253 образцов мононуклеарной фракции крови (ЛП, лейкоконцентраты), стимулированной периферической крови и эксфузатов костного мозга было проведено изучение мембранной экспрессии антигенов, ассоциированных с ГСК различного уровня дифференцировки.

В таблице 2. представлены основные фундаментальные изменения экспрессии БММП ГСК в 1187 пробах онкологических больных и здоровых доноров. Эти же данные представлены в виде диаграммы профиля этих специфичных для ГСК мембранных протеоинов (фиг. 1), которая наглядно иллюстрирует, что межклеточный информационный белковый взаимообмен между ОК и ГСК пациента очень серьезно и статистически достоверно изменяет протеомный состав экспрессирующих мембранных белков ГСК онкологических пациентов.

Сравнительный анализ экспрессии маркеров клеточной поверхности ГСК у здоровых доноров и онкологических пациентов (взрослых и детей) демонстрирует выраженное снижение экспрессии целого ряда поверхностных белков клеточной поверхности (CD38+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD61+) более чем в два раза у взрослых онкологических больных. В то же время у этого контингента онкобольных на ГСК появляются высокая концентрация CD 117+ и новые белковые маркеры клеточной поверхности (CD10+ и CD2+), которых в норме на поверхности ГСК здоровых доноров никогда не обнаруживались.

В таблице 3. представлены основные фундаментальные изменения экспрессии БММП ГСК в 1187 пробах онкологических больных, 54 пробах здоровых доноров и 86 пробах больных с БАС.

В то же время у детей с онкопатологией, также на фоне общей тенденции снижения тех же белковых маркеров клеточной поверхности (CD38+, CD71+, CD90+, CD117+, CD56+, CD 19+, CD61+) и появления ранее неизвестных маркеров клеточной поверхности (CD2+, CD 10+), отмечается отчетливое повышение концентрации маркера CD45+.

Как видно на диаграммах (фиг. 2-4), у всех больных БАС на поверхности клеточных мембран аутологичных ГСК практически отсутствует маркер CD38+, а также резко снижены показатели CD117+ и CD71+, а у больных с онкологическими заболеваниями отмечено значительное подавление маркера CD33+ и маркеров CD71+ и CD90+ (Thy-1). БАС это генетически детерминированное аутоиммунное нейроинфекционное заболевание, при котором иммунные клетки вызывают локальное воспаление в боковых столбах спинного мозга, и результатом этого воспаления является дегенеративный процесс.При онкологическом заболевании клетки иммунной системы не контролируют рост и пролиферацию клеток, и результатом является бесконтрольный опухолевый рост. И в том, и в другом случае очевидны нозоспецифические изменения профиля экспрессии БММП ГСК у этих больных, что стало важным критерием патоморфологического протеомного изменения экспрессии белковых антигенов на клеточной поверхности ГСК и легло в основу молекулярно-биологической диагностики этих болезней согласно настоящему изобретению. Возможно, что эти изменения протеомики мембранных антигенов ГСК и гемопоэтических прогениторов имеют место и при других нейродегенеративных заболеваниях человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Пика, синильное слабоумие, системные корковые и мозжечковые атрофии и т.д.), а не только при БАС. Но этот факт требует отдельной проверки и дополнительного изучения.

Проведенная с участием авторов настоящего изобретения серия экспериментов по профилированию БММП ГСК в случаях семейного БАС показала ту же закономерность, которая и ожидалась. У всех больных с семейной формой БАС были отмечены иммуноспецифические особенности антигенов поверхности ГСК и отличия между больными БАС и их здоровыми родственниками, содержащими эту мутацию, были минимальны. Для иллюстрации в качестве примера ранней молекулярно-биологической диагностики семейного БАС на фиг. 3 представлены отличия профиля терминальной больной БАС (младшая сестра), находящейся на аппарате исскуственной вентиляции легких, и здоровой сестры больной без признаков заболевания. По иммунофенотипическому профилю ГСК донора (здоровая сестра больной) и больного БАС (сама больная) получены лишь расхождения по ряду антигенов. У донора, в отличие от реципиента, выявлено большее число CD117+, CD33+, CD28+, CD300+, CD11b+, CD123+ клеток-предшественников. Выявлено различие в количестве CD38+ предшественников, но у донора и реципиента экспрессия данного антигена слабая. Популяция ГСК, преобладающая у донора, характеризует моноцитарную направленность дифференцировки клеток-предшественников. Другими словами, по диаграмме иммунофенотипического профиля аутологичной ГСК можно диагностировать факт заболевания задолго до того, как появится манифестация болезни у больного с семейной формой БАС, и без генетического анализа увидеть тех членов семьи, кто несет эту мутацию и имеет высокий риск развития клинических проявлений болезни.

При анализе иммунофенотипического профиля ГСК у различных больных со спорадическими формами заболевания получены отчетливые иммуноспецифические изменения протеомного профиля антигенов клеточной поверхности ГСК (фиг. 4). У больных со спорадическими формами БАС, в отличие от нормы, выявлено большее число CD117+ CD33+ CD28+CD300+CD11b+CD123+ клеток-предшественников. Выявлено различие в количестве CD38+ предшественников, но у донора и реципиента экспрессия данного антигена слабая.

Авторами изобретения были проведены достаточно масштабные и статистически достоверные исследования БММП ГСК у большого количества онкологических больных с разными типами рака и ЗНО, что позволяет исключить ошибку малых чисел. Количество больных с БАС было всего 62 человека, но результаты позволяют сделать верные и статистические обоснованные диагностические выводы, что подтверждает достоверность способа по настоящему изобретению.

Центральным научным фактом, на котором основан способ диагностирования по настоящему изобретению, явились онкоспецифические протеомные изменения (модификации) профиля экспрессии БММП ГСК у онкологических больных. Эти изменения в качестве самого раннего объективного признака возникновения рака и наличия противоопухолевой несостоятельности (недостаточности) иммунной системы, способны стать основными критериями раннего диагностирования рака. Доказательством этого научного факта стали полученные авторами настоящего изобретения статистически достоверные данные об онкоспецифической модификации протеомного профиля мембранной поверхности ГСК у онкологических пациентов, что позволяет получить сравнительный анализ результатов клеточно-биологического и молекулярно-биологического исследования экспрессии мембранных белков ГСК у больных с онкологическими заболеваниями и здоровых доноров. Эти исследования крупномасштабно описаны в монографии А.С. Брюховецкий «Онкопротеомика: персонализированные противоопухолевые клеточные препараты», 2014. Исследования, выполненные на современном масс-спектрометрическом оборудовании, позволили увидеть и сформировать определенный набор фундаментальных отличий экспрессии БММП ГСК больных с онкологическими заболеваниями с вариациями у взрослых и детей от аналогичных БММП ГСК здоровых людей (доноров), не имеющих клинических и лабораторных признаков онкологического заболевания.

Полученные данные об иммуноспецифичных протеомных изменениях при профилировании БММП ГСК у онкологического больного свидетельствуют об определенном локальном онкоспецифическом изменении протемного профиля (онкопротеоме) БММП ГСК и селективной онкомодификации определенной части пептидной картограммы ГСК у онкобольных. Возможно, именно с этим научным фактом связаны избирательные нарушения функций иммунной системы против опухоли при полной сохранности иммунных возможностей по борьбе с инфекциями, вирусами, грибками и т.д. Иммунная система человека, все клетки которой являются потомками собственных ГСК с измененным онкоспецифичным профилем БММП, перестает реагировать на наличие большого количества ОК в организме больного и осуществлять надзор и контроль за их количеством. Именно это обстоятельство и формирует противоопухолевую НИС пациента с наличием рака и ЗНО.

Когда стало очевидно, что по маркерам клеточной поверхности ГСК у онкологических больных можно диагностировать наличие противоопухолевой НИС, а также оценивать текущее состояние иммунной системы пациента, авторы изобретения предположили, что при БАС эти отличия ландшафта БММП ГСК должны быть кардинально отличными от подобных показателей при раке и в норме. В свете выявленных особенностей информационного обмена между ОК и ГСК, включающих в себя как горизонтальный, так и вертикальный обмен цитопазматическими белками (Брюховецкий И.С. с соавтю, 2017), нельзя исключить аналогичного информационного обмена между клетками нервной ткани с SOD-1 мутацией и здоровой ГСК или ГСК с SOD-1 мутацией и здоровым нейроном, а также между лимфоцитами периферической крови, содержащими SOD-1 мутации с нейронами. Авторы пришли к выводу о том, что механизмы межклеточного информационного обмена между мутантными ОК и ГСК и их прогениторами универсальны и в полной мере могут отражать процесс информационных межклеточных взаимодействий ГСК и поврежденного мотонейрона при БАС, где мутантная ГСК_SOD-1 встречается с клетками нервной ткани в зоне повреждения гематоэнцефалического барьера, и все процессы происходящего межклеточного обмена идентичны процессам при онкологическом заболевании. Очевидно, что авторами изобретения на моделях межклеточных взаимоотношений между различными опухолями и ГСК был выявлен уникальный системный коммутационный молекулярно-биологический механизм информационного межклеточного взаимодействия ГСК, содержащих мутации с тканеспецифичными клеточными системами. А раз этот механизм является важнейшим инструментарием взаимодействия между мутантной ОК и ГСК, то он должен также работать и с лимфоцитами, содержащими SOD-1 мутацию и ГСК, содержащую эту мутацию. Поскольку любая мутация в геноме ГСК приводит к появлению иммуноспецифичных транскриптомных и протеомных нарушений в картированном белковом профиле клетки, то это будет обязательно отражено на поверхности ГСК и при БАС. Предположения авторов изобретения полностью оправдались, и на мембранной поверхности ГСК у больных с БАС был обнаружен очень специфичный иммунофенотипический профиль БММП ГСК, названный авторами как нейроспецифический, а НИС при БАС авторы обозначили как нейродегенеративную НИС. На диаграммах (фиг. 1 и 2) видны отличия между профилями БММП ГСК в норме, у здорового донора, при раке и БАС.

Таким образом, онкоспецифический профиль БММП ГСК значительно отличается от профиля БММП здоровой ГСК и характеризуется наличием гиперэкспресии CD 81+ маркера и гипоэкспрессии CD 38+, CD33+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD28+, CD300+ и CD2+ маркеров по сравнению с нормой. Нейроспецифический профиль БММП ГСК также значительно отличается от профиля БММП здоровой ГСК и характеризуется наличием гипоэкспресии HLA DR+, CD38+, CD13+, CD71+, CD117+, CD90+, CD50+, CD19+ маркеров, гиперэкспрессии CD56+, CD61+, CD2+ и суперэкспрессии CD7+ и CD81+ маркеров по сравнению с нормой. Фенотипические характеристики выявленных особенностей профилей БММП ГСК свидетельствуют о иммуноспецифической избирательной НИС, которая формируется еще до появления тканевого патоморфоза болезни и обусловлена геномно-протеомной патологией ГСК.

Учитываю первичную онкологическую специфику описанного научного феномена, остановимся на возможностях, которые открывают эти научные факты для онкологической клиники. Во-первых, выявленные изменения касаются достаточно большой выборки онкологических больных с различными онконозологиями и, соответственно, эти протеомные изменения БММП ГСК являются интегральными маркерами состоявшейся опухолеспецифичной (онкоспецифической) протеомной модификации ГСК. То есть, выявление таких маркеров на ГСК человека свидетельствует о том, что он «дожил до своего рака» и регистрирует факт наличия у него хронической недостаточности функции противоопухолевой иммунной защиты. Следовательно, если у человека уже есть подобные изменения на клеточной поверхности ГСК, то у него уже есть рак и он еще не выявлен, но может манифестировать в любое время. Таким образом, появляется еще один не менее важный, чем онкомаркеры, комплекс альтернативных информационных данных, позволяющий диагностировать рак на самой ранней стадии. Если рак у пациента не выявлен онкомаркерами, то больной просто недостаточно обследован или рак еще не обрел черты тканевой специфичности. Поэтому такой больной требует усиленного динамического наблюдения онколога. Во- вторых, выявленные общие закономерности трансформации белковых маркеров отражают системность повреждения ГСК у онкологического больного и не зависят от иммунотканевой и гистохимической структуры опухоли. Этот специфичный набор БММП ГСК у человека отражает несостоятельность противоопухолевой функции иммунной системы независимо от локализации и органной принадлежности опухоли. В-третьих, данные протеомные изменения экспрессии мембранно-клеточного ландшафта на ГСК у онкологических больных являются основной причиной «ускользания» ОК и ОСК от клеток врожденного иммунитета (NK-клеток, NKT-клеток, γδ Т-клеток и В-клеток) и иммунных клеток, формирующих первичный и вторичный иммунный ответ (цитотоксические лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги), так как эти клеточные системы у онкологического больного являются потомками модифицированной опухолью ГСК. Эти ГСК и их потомки (все клетки иммунной системы) уже получили «прививку иммунотолерантности» к конкретной опухоли и не будут ее уничтожать, даже если будут значительно активированы.

Не менее важным является полученный анализ экспрессии БММП ГСК как фундаментальный критерий для научного обоснования целесообразности проведения иммунотерапии у онкологических больных с установленным диагнозом рака или других ЗНО. Если профилирование экспрессии БММП ГСК соответствует профилю экспрессии белков нормальной ГСК, то проведение иммунотерапии нецелесообразно и не требуется. Это позволяет утверждать, что собственные возможности и ресурсы иммунитета человека достаточные и в усилении не нуждаются. Если при исследовании экспрессии БММП ГСК выявляется их типичный онкоспецифический протеомный профиль, то из этого следует то, что все иммунокомпетентные клетки в организме человека не способны оказывать противоопухолевое действие и заместительная иммунотерапия, направленная на протезирование противоопухолевой функции иммунной системы обследуемого должна стать обязательным компонентов противоопухолевого лечения еще до факта установленной тканевой специфичности этой опухоли.

Становится очевидным, что выявленные фундаментальные морфо-функциональные биологические отличия ландшафта экспрессии БММП ГСК у онкологического больного обусловлены геномными и постгеномными изменениями в структуре сетей ДНК и РНК, а также протеоме этих клеток - родоначальниц всех клеток иммунной системы. При этом становится понятно, что все клетки-потомки этих онкомодифицированных ГСК будут не способны выполнять свои системные эффекторные противоопухолевые функции в иммунной системе хозяина и требуют определенной, строго заданной коррекции на уровне генома и постгеномных уровней (транскриптома, протеома и метаболома).

В отношении изучения субпопуляций принципиальным с клинической точки зрения является вопрос, насколько вклад каждой из субпопуляций ГСК определяет эффект онкоспецифической модификации ГСК в целом, а также необходимо оценить вклад каждой популяции ГСК в иммунотерпию рака. Преобладание той или иной субпопуляции может оказаться существенным в отношении ранней диагностики различных типов рака и это надо изучать дополнительно.

Проведенные исследования экспрессии БММП ГСК показали, что на основании целого ряда маркеров клеточной поверхности ГСК у онкологического больного можно на ранних стадиях прогнозировать системную противоопухолевую НИС пациента -слабую иммуногенность ОК для эффекторных клеточных систем врожденного иммунитета у онкологического больного, недостаточную регуляторную функцию ГСК пациента на ОСК и ОК и предвидеть низкий первичный и вторичный иммунный ответ на опухолевые антигены новообразования. То есть, еще до клинических и параклинических признаков наличия и манифестации опухолевого заболевания можно иметь достоверный факт изменения репертуара протеомного профиля БММП ГСК, что будет свидетельствовать о высокой вероятности развития опухоли у данного пациента или ее наличия вообще. Вопрос о том где и в каком конкретно органе или ткани произойдет «молекулярно-биологический пробой» иммунной системы у данного пациента, еще требует уточнения и понимания. Тем не менее, уже сегодня можно говорить о возможности осуществления молекулярной иммуноспецифической диагностике рака и других ЗНО и БАС по ГСК-мобилизованной крови человека. Сам факт подтверждения наличия опухолеспецифического ландшафта БММП ГСК у конкретного пациента предполагает высокую возможность (до 90%) возникновения ЗНО, даже если опухоль не еще не диагностируется клинически и ее нельзя обнаружить методами современной параклинической диагностики (ПЭТ, ПЭТ-КТ, радиоизотопная диагностика, интраоперационное иммуноцитофлюоресцентное окрашивание и т.д.).

Значение установленных при создании настоящего изобретения молекулярно-биологических научных фактов для неврологии БАС может стать фундаментальным и стать основой ранней диагностики этого фатального заболевания. Исследования БММП ГСК у больных БАС демонстрируют реальную возможность диагностики семейных форм БАС и позволяют прогнозировать возможность развития болезни у членов семьи, несущих ГСК SOD-1 мутацию в своих кроветворных стволовых клетках. Очевидно, что при семейной форме БАС накопление в ГСК патологических белков, обусловленных SOD-1 мутацией, приводит к углублению протеомных отличий БММП ГСК, и цитофлюориметрический анализ маркеров этих клеток позволит на самых ранних этапах болезни диагностировать начавшийся процесс дегенерации в моторных нейронах, еще до того времени, пока болезнь не манифестирует специфическими клиническими нарушениями и станет верифицироваться как повреждение мотонейрона в спинном мозге человека-носителя этой патологической мутации. Представляется, что после углубленного изучения этого феномена и его достаточного статистического подтверждения, этот диагностический тест станет краеугольным камнем в ранней диагностике БАС и позволит по-новому посмотреть на это заболевание, мониторировать возможность развития дегенерации в ЦНС на самых ранних этапах и остановить болезнь на самых ранних подступах.

Очевидно, что установленные авторами изобретения научные факты протеомных модификаций ГСК у пациентов с семейным БАС позволяют утверждать, что первичными являются геномно-протеомные изменения в ГСК, которые диагностируются у родственников больных БАС, не имеющих клинических проявлений болезни повреждения мотонейронов, а только потом наступают нейродегенеративные изменения в мотонейронах. Геномно-протеомные нарушения ГСК так же первичны и при спорадическом БАС и возникают в результате воздействия этиологических факторов болезни на костный мозг пациента и ГСК, циркулирующие в периферической крови.

Предложенный способ ранней диагностики рака и БАС позволяет структурировать новые подходы к геномным и постгеномным технологиям в терапии рака, других ЗНО и БАС и позволяет определить новые молекулярно-биологические цели и мишени в лечении этих заболеваний.

Другой иллюстрацией клинической реализации настоящего изобретения является диагностика БАС по образцу криоконсервированного в 2004 году лейкоконцентрата мобилизованных мононуклеаров периферической крови больного А.Р., лечившегося в 2004 году в клинике "НейроВита" и тогда осуществившего сбор ГСК, но умершего в 2005 году от дыхательного паралича. По профилям БММП ГСК кроветворных образцов у 8-ми человек (биоматериал 2-х здоровых доноров в пробах 1-2, 4-х больных с травмой спинного мозга (пробы 3-5,7), проба 6 от больного А.Р. с БАС и проба 8 от больного с метастатическим плоскоклеточным раком легкого) независимый врач лаборатории иммунологии с использованием способа по настоящему изобретению самостоятельно установил диагноз нейродегенеративной НИС при БАС по нейроспецифическому профилю и диагноз противоопухолевой НИС (фиг. 5).

БАС в рамках нашего понимания патогенеза этой болезни является не «болезнью моторного нейрона», как считает большинство современных неврологов во всем мире, а геномно-протеомной болезнью собственной ГСК. Это открытие впервые дает возможность полной остановки этой болезни и предотвращения неизбежного летального исхода путем аллогенной трансплантации иммуносовместимого костного мозга, имеющего здоровые ГСК. Требуют дополнительного изучения возможности ранней диагностики системных атрофических заболеваний в центральной нервной системе человека с использованием предложенного способа, и возможно, что и при этих заболеваниях также основная патология будет обнаружена в ГСК, а не клетках коры или мозжечка нервной ткани.

Перечень используемых сокращений

БАС - боковой амиотрофический склероз

БММП - белковые маркеры мембранной поверхности

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГСК - гемопоэтическая клетка

ЗНО - злокачественное новообразование

ЛП - лейкоферезный продукт

НИС - недостаточность иммунной системы

НХЛ - неходжскинские лимфомы

ОК - опухолевая клетка

ОСК - опухолевая стволовая клетка

СК - стволовая клетка

Изобретение относится к онкологии и неврологии. Способ ранней молекулярно-биологической иммуноспецифической диагностики злокачественных заболеваний (ЗНО) или бокового амиотрофического склероза (БАС) включает в себя иммунофенотипирование мембранных антигенов гемопоэтической стволовой клетки (ГСК) обследуемого субъекта с последующим картированием и профилированием основных белковых маркеров мембранной поверхности (БММП) ГСК этого субъекта и сравнительный анализ показателей экспрессии белков полученного профиля (исследуемого профиля) с аналогичными параметрами протеомного профиля БММП ГСК (нормального профиля), если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гиперэкспрессию CD81+ маркера и гипоэкспрессию CD 38+, CD33+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD28+, CD300+ и CD2+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют онкоспецифический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта; если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гипоэкспрессию HLA DR+, CD38+, CD13+, CD71+, CD117+, CD90+, CD50+, CD19+ маркеров и гиперэкспрессию CD56+, CD61+, CD2+, CD7+ и CD81+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют БАС-специфический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

1. Способ ранней молекулярно-биологической иммуноспецифической диагностики злокачественных заболеваний (ЗНО) или бокового амиотрофического склероза (БАС), включающий в себя иммунофенотипирование мембранных антигенов (CD-маркеров) гемопоэтической (CD34+ CD45+ HLA DR+) стволовой клетки (ГСК) обследуемого субъекта с последующим картированием и профилированием основных белковых маркеров мембранной поверхности (БММП) ГСК этого субъекта и сравнительный анализ показателей экспрессии белков полученного профиля (исследуемого профиля) с аналогичными параметрами протеомного профиля БММП ГСК (нормального профиля), установленного для статистически значимой группы здоровых доноров костного мозга, причем, если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гиперэкспрессию CD81+ маркера и гипоэкспрессию CD 38+, CD33+, CD71+, CD90+, CD56+, CD19+, CD28+, CD300+ и CD2+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют онкоспецифический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта; если в результате сравнительного анализа исследуемого и нормального профилей устанавливают гипоэкспрессию HLA DR+, CD38+, CD13+, CD71+, CD117+, CD90+, CD50+, CD19+ маркеров и гиперэкспрессию CD56+, CD61+, CD2+, CD7+ и CD81+ маркеров в исследуемом профиле по сравнению с нормальным профилем, то диагностируют БАС-специфический профиль БММП ГСК у обследуемого субъекта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что протеомные профили БММП ГСК получают методом мультицветной проточной цитофлюориметрии в гейте CD34+ CD45+ ГСК со стандартными специфическими антителами к мембранным антигенам.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ГСК получают из эксфузата костного мозга обследуемого субъекта или из его периферической крови, мобилизованной стимуляцией гранулоцитарным или гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором и взятой у обследуемого субъекта из любого венозного доступа.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у родственников больных БАС с диагностированным БАС-специфическим профилем БММП ГСК диагностируют наличие семейной формы заболевания.