СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН И ОЖОГОВ "КОЛЛАГЕЛЬ" Российский патент 1999 года по МПК A61K9/06 A61K38/48 

Изобретение относится к фармакологии и биотехнологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для лечения гнойно-некротических ран у людей и животных.

Поиск средств, эффективных для лечения ран различной этиологии, вызванных механическим повреждением тканей, ожогами, обморожениями, хирургическим вмешательством, является актуальной проблемой современной медицины и фармакологии.

Среди протеолитических ферментов особый интерес у исследователей вызывает фермент коллагеназа. Помимо присущего многим протеазам некролитического действия, коллагеназа оказывает избирательное действие на коллаген, основной компонент соединительной ткани. В связи с этим, препараты на основе коллагеназы применяют для удаления рубцов, в том числе келлоидных.

В настоящее время существует несколько коммерческих препаратов, содержащих коллагеназу. Один из них - мазь "Ируксол" производства Хорватии, которая содержит коллагеназу из культур Clostridium histolyticum. В отечественной медицинской практике разработан ряд препаратов, содержащих коллагеназу, выделенную из того же бактериального источника: коллализин - для лечения стоматитов, кариеса, различных воспалительных заболеваний глаз; коллапор - для лечения отитов, стоматитов; коллагеназа - для лечения ран и ожогов, с целью ускорения отторжения струпов и некротизированных тканей [1].

Однако для получения фермента, входящего в состав этих препаратов, используется патогенный бактериальный штамм, в связи с чем технологический процесс выработки препарата требует специального оборудования и условий труда.

Известен препарат на основе коллагеназы, полученной из гепатопанкреаса камчатского краба [2]. Препарат представляет собой аморфный порошок, используемый в дозе 0,5 мг/см² в ветеринарии для лечения гнойных ран конечностей животных.

Однако данный препарат имеет низкую степень очистки и применяется только в ветеринарии. Порошок неудобен в применении, т.к. требуются дополнительные средства (марлевые повязки) для удержания препарата на поверхности раны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является состав для лечения гнойно-трофических язв и пролежней, содержащий морикразу (комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью), ланолин, парафин и основу в виде жира Эйглисол [3] при следующем соотношении компонентов (мас.%):
морикраза - 0,25-1,6
ланолин - 4,0-5,0
парафин - 12,0-15,0
основа в виде жира Эйглисол - остальное
Морикраза имеет следующий ферментный состав: коллагеназа, трипсин, химотрипсин, эластаза, карбоксипетидазы A и B.

Недостатком указанного средства является то, что основной биологически активный компонент (морикраза) имеет комплекс ферментов с низкой степенью очистки. При этом требуется значительное количество морикразы для обеспечения достаточной биологической активности (в 10 раз и более, чем в предлагаемом препарате). Низкая степень очистки морикразы может привести при накожном применении препарата в медицине к сильным аллергическим реакциям у пациента. Например, при частом нанесении на кожу такого компонента, как эластаза, последняя может вызывать некоторые заболевания вследствие ее токсического и аллергического действия [4-7]. В этой связи данное лечебное средство на основе морикразы требует ограничения по длительности применения, а для части пользователей, склонных к аллергии, оно может быть и вовсе противопоказано.

Задачей предлагаемого технического решения является создание такого дерматологического лечебного препарата на основе комплекса протеолитических ферментов, которое имело бы более высокую степень ферментативной активности и не вызывало бы аллергических реакций при длительном применении.

Указанная задача решается тем, что в средстве для лечения гнойно-некротических ран и ожогов, включающем комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба и основу, согласно изобретению, средство дополнительно содержит местное анестезирующее вещество, буферную добавку, бактериостатик и дистиллированную воду, в качестве комплекса протеолитических ферментов используют коллазу, а качестве основы - гель полиэтиленоксида при следующем количественном соотношении компонентов (мас.%):
коллаза - 0,01-0,1
местное анестезирующее вещество - 2,0-5,0
буферная добавка - 0,05-0,7
бактериостатик - 1,0-3,0
дистиллированная вода - 4,0-7,0
гель полиэтиленоксида - остальное
В качестве местного анастезирующего вещества используют тримекаин, в качестве буферной добавки - гидроокись калия, а в качестве бактериостатика - борную кислоту.

Ферментный препарат коллаза, выделенный из гепатопанкреаса Камчатского краба (Paralithodes camtschatica), представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической и казеинолитической активностью (ВФС 42-399 ВС-9, введен в действие с 12.07.93 г.). Препарат обладает некролитической активностью, обусловленной действием двух изоферментов сериновой коллагенолитической протеазы A и C; расщепляет коллаген, способствующий старению кожи человека; имеет фибринолитические и тромболитические свойства. Протеолитическая активность - не менее 0,4 ед.а./мг белка. Коллагенолитическая активность при pH 7-8 составляет не менее 500 ед.а./мг белка. Препарат практически не теряет активности в течение 4-х лет хранения в лиофильно высушенным состоянии при температуре +10^oC.

Кислота борная (ГФХ ст 010 65) в составе служит бактериостатиком (консервантом) и антисептиком.

Тримекаин (ФС 42-2390-85) оказывает анестезирующее действие.

Основа - гель полиэтиленоксида (ТУ 9154-004-11821987-93) придает средству желеобразное состояние, повышает удобство пользования указанным средством. Кроме того, гель полиэтиленоксида сам по себе смягчает и увлажняет кожу, способствует лучшему проникновению биологически активных веществ и ферментов через кожный барьер.

Вода дистиллированная соответствует ГОСТу 6709-72.

Буферная добавка - калия гидроокись (ГОСТ 24363-80) обеспечивает значение водородного показателя 7,0-8,0 ед. pH и совместно с борной кислотой образует буферную систему.

лечебная мазь "Коллагель" имеет белый цвет, без запаха, не растворима в воде, спирте, эфире, растворах кислот и щелочей. Подлинность препарата выявляется в процессе количественного определения протеолитической активности по продуктам расщепления казеината натрия, гидролиз которого вызывает коллаза.

Ниже приводятся примеры составов предлагаемой мази "Коллагель".

Пример 1. Состав "Коллагель" с минимальным количественным соотношением компонентов (мас.%):
коллаза - 0,01
тримекаин - 2,0
гидроокись калия - 0,05
борная кислота - 1,0
дистиллированная вода - 4,0
гель полиэтиленоксида - остальное
Пример 2. Состав "Коллагель" со средним количественным соотношением компонентов (мас.%):
коллаза - 0,05
тримекаин - 3,5
гидроокись калия - 0,35
борная кислота - 2,0
дистиллированная вода - 5,5
гель полиэтиленоксида - остальное
Пример 3. Состав "Коллагель" с максимальным количественным соотношением компонентов (мас.%):
коллаза - 0,1
тримекаин - 5,0
гидроокись калия - 0,7
борная кислота - 3,0
дистиллированная вода - 7,0
гель полиэтиленоксида - остальное
Составы (примеры 1-3) мази "Коллагель" стабильны при хранении при температуре +7^oC в течение 12 месяцев. При уменьшении указанного в примере 1 количества биологически активных веществ, средство не будет оказывать заметного лечебного действия. Увеличение содержания компонентов мази выше значений, указанных в примере 3, не повышает ее активность, но при этом значительно увеличивается расход биологически активных веществ, что сопровождается удорожанием продукта.

Пример 4. Технология приготовления мази "Коллагель" на основе коллазы
При производстве лечебной мази "Коллагель" используется простое технологическое оборудование, укомплектованное реактором с мешалкой.

Для приготовления препарата в реактор с мешалкой загружают гель полиэтиленоксида при температуре +15 - 25^oC и добавляют при перемешивании согласно приведенной выше рецептуры (примеры 1-3) следующие компоненты: тримекаин, борную кислоту и раствор гидроокиси калия в дистиллированной воде. После перемешивания компонентов в течение 20-30 минут измеряют pH смеси. Если pH продукта оказывается ниже 7,0-8,0 (гель полиэтиленоксида имеет кислую среду), то в состав дополнительно вводят раствор гидроокиси калия в количестве, достаточном для обеспечения в составе pH = 7,0-8,0. Далее смесь еще раз гомогенизируют в реакторе в течение 20-30 минут, автоклавируют и после остывания перемешивают с раствором коллазы. Готовую мазь "Коллагель" расфасовывают в тару и хранят при температуре +8-10^oC.

Пример 5. Количественное определение протеолитической активности и микробиологической чистоты препарата "Коллагель"
Метод основан на гидролизе казеината натрия ферментным препаратом коллаза до пептидов и аминокислот с последующим их определением. За единицу протеолитической активности принята способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30^oC казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой (ТХУ) состояние в количестве, соответствующем 1 ммоль тирозина.

Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата в перерасчете на сухое вещество.

Определение проводят по ГОСТ 20264.2-88 (разд. 2 для нейтральных протеиназ).

Протеолитическая активность 1 г мази составляет от 0,4 до 2,1 ПЕ.

Микробиологическую чистоту определяют согласно ГФ Х10 т. 2, стр. 193. В 1 г мази содержится не более 100 жизнеспособных микроорганизмов. Представители семейств Enterobacteriaceae, P.aeruginosa и Staf.aureus отсутствуют.

Пример 6. Исследование безвредности фермента коллазы, являющегося компонентом мази "Коллагель"
Токсические свойства фермента коллазы изучали на белых беспородных мышах ICR, самцах, массой 29-31 г. Оценку кожно-резорбтивного и местно-раздражающего действия проводили на самках крыс линии Wistar, с массой тела 250-290 г, и кроликах породы "Шиншилла", самцах, массой 2,0-3,0 кг. Для исследования аллергизирующих свойств препарата были использованы морские свинки обоего пола, массой 350-400 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария, на сбалансированном пищевом рационе.

Результаты изучения токсических свойств фермента коллазы
Для изучения токсического действия препарата использован внутрижелудочный способ введения препарата. Установлено, что однократное внутрижелудочное введение препарата в дозе 5 г/кг массы тела не вызывало гибели животных в течение всего эксперимента, что позволяет отнести препарат к классу малоопасных веществ, согласно ГОСТ 12.1.007-76.

Введение препарата не приводило к нарушению поведенческих реакций, потребления пищи и воды. Значения массы тела, пульс и двигательная активность животных после введения коллазы колебались в пределах физиологической нормы. Отмеченное снижение температуры тела мышей в первые 5 ч наблюдения не выходило за границы нормальных значений этого показателя для данного вида животных (табл. 1) (табл. 1-3 см. в конце описания).

Не обнаружено статистически значимых изменений весовых индексов и макроскопической картины внутренних органов.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что однократное внутрижелудочное введение препарата в дозе 5 г/кг массы тела не оказывает выраженного токсического действия на организм лабораторных животных.

Результаты исследований местно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия фермента коллазы
Девятикратное нанесение препарата в объеме 0,1 мл на участок кожи спины крыс, лишенный волосяного покрова, не вызывало изменения температуры и массы тела животных. Колебания показателя частоты сердечных сокращений опытных животных через сутки после аппликаций и в конце 10-дневного восстановительного периода не выходили за пределы физиологической нормы для этого вида животных. Тестирование в "открытом поле" не выявило изменений двигательной, ориентировочной и эмоциональной реакций.

Гематологические показатели в опытной группе животных в течение всего периода наблюдения не отличались от контрольного уровня.

Аппликации препарата не приводили к существенным изменениям весовых индексов внутренних органов, хотя в конце восстановительного периода в опытной группе животных отмечено статистически достоверное снижение индекса тимуса и возрастание весового индекса сердца. Следует отметить, что колебания этих показателей не выходили за границы диапазона значений, нормальных для этого вида животных. Макроскопическая картина внутренних органов у крыс контрольной и опытной групп существенно не отличалась.

Однократное нанесение препарата не вызывало каких-либо признаков раздражения слизистых оболочек глаз кроликов (выделений, отека век, сосудистых реакций).

Следовательно, фермент коллаза не обладает кожно-резорбтивным действием.

Девятикратное нанесение раствора коллазы на кожу спины не вызывало визуальных изменений состояний неповрежденной кожи.

При гистологическом излучении кожи крыс через сутки после окончания аппликаций препарата наблюдались изменения в виде утолщения эпидермиса, в основном, за счет зернистого слоя, дистрофические изменения эпидермальных клеток, отмечалась лейкоцитарная инфильтрация дермы. В случае небольших повреждений кожи при стрижке в дерме развивалась выраженная воспалительная реакция с обильной полиморфно-ядерной инфильтрацией и гиперемией. Через 10 сут после окончания аппликаций микроструктура кожи у опытных животных не отличалась от контроля.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что препарат "Коллагель" при многократном нанесении на интактную кожу обладал умеренно выраженным раздражающим действием, которое исчезало к концу восстановительного периода.

Результаты излучения аллергизирующих свойств фермента коллазы
Данные исследования кожно-сенсибилизирующей и анафилактогенной активности препарата представлены в табл.2.

Из данных таблицы следует, что при кожном тестировании и при тестировании методом конъюктивальной пробы препарат не проявил выраженных сенсибилизирующих свойств.

Результаты токсикологической оценки фермента показали, что препарат относится к классу малоопасных веществ. При многократном нанесении на неповрежденную кожу крыс ферментный препарат не оказывал токсического воздействия на состояние жизненно важных органов и систем.

Пример 7. Исследование действия мази "Коллагель" при длительном применении
Данные по излучению действия мази коллазы при длительном (в течение трех месяцев) апплицировании крысам и кроликам обоего пола свидетельствуют о том, что препарат в дозах от 160 до 600 мг не вызывает изменения поведенческих реакций, не оказывает влияния на общее физиологическое состояние, динамику массы и температуры тела животных.

Трехмесячное применение мази коллазы не оказывает влияния на функциональное состояние печени, выделительной и сердечно-сосудистой систем. В испытанных дозах препарат не влияет также на гематологические показатели, уровень углеводного, белкового, нуклеинового обменов и функцию поджелудочной железы.

Отсутствие токсических эффектов мазей формы препарата "Коллагель" на состояние важнейших органов и систем организма разных видов лабораторных животных в хроническом эксперименте было подтверждено результатами патоморфологических и гитстологических исследований внутренних органов.

Мазевая форма препарата "Коллагель" не обладает выраженными сенсибилизирующими и иммунотоксическими свойствами.

Таким образом, на основании проведенного токсикологического исследования мази "Коллагель" не обнаружено токсических свойств, которые явились бы противопоказанием для использования препарата в медицине и ветеринарии.

Пример 8. Исследование ранозаживляющей активности мази "Коллагель".

Изучение эффективности препарата проводили на модели инфицированной раны. Животным после депиляции кожи в области спины под наркозом наносили плоские кожные раны диаметром 2,0 см. В раны вносили 0,5 • 10⁹ микробных тел бактериальной суспензии, содержащей суточные культуры P. aeruginosa (ATCC-27853), S. aureus (ATCC-25923). Все животные были разделены на 4 группы, по 10 особей в каждой. В первой, контрольной, группе лечение не проводили. На раны животных второй группы апплицировали мазь "Ируксол" (Плива, Хорватия), которая содержит клостридиопептидазу A (препарат сравнения). Животные третьей группы получали основу испытуемой мазевой формы. Крыс 4 экспериментальной группы лечили мазью "Коллагель", содержащей 0,2 мг коллазы/г мази. Наблюдения за животными вели с момента инфицирования ран, мазь наносили ежедневно с помощью стерильных шпателей после формирования гнойно-некротических ран, начиная с третьих сут после инфицирования. При этом оценивали признаки воспаления и проводили планиметрические исследования. На 3, 5, 6 и 7 сут лечения у крыс забирали кровь для гематологического и биохимического исследования, из дна ран иссекали кусочки ткани для гистологического анализа.

Для статистической обработки полученных данных использовали t критерий Стъюдента.

К моменту начала лечения раны подопытных животных имели ярко выраженный гнойно-некротический характер с соответствующими клиническими признаками. После лечения в течение четырех сут произошло резкое сокращение размеров ран у животных 1-4 групп (на 66-70%) (табл. 3). Визуально более благоприятными по картине заживления были раны у крыс второй и четвертой групп: раны были покрыты тонкими сухими корочками, у 75% крыс корочки отпали, дно у ран было чистое и розовое. У крыс первой и третьей групп регистрировались более выраженные корки, отмечался краевой валик у животных третьей группы. В последующие трое сут происходило отделение раневого струпа и практически полное заживление ран у крыс 1, 2 и 4 групп.

Изменение гематологических показателей периферической крови (увеличение количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, тромбоцитов по сравнению с исходными данными) и повышение активности аспартатаминотрансферазы отмечалось у животных и опытных, и контрольных групп, что указывает на их связь с интоксикацией и болевым раздражением со стороны инфицированной раны, а не с токсическим воздействием коллагеназы и других компонентов мази. При этом отмечена меньшая выраженность обнаруженных изменений под влиянием коллазосодержащей мази (группа 4) по сравнению с широко применяемой в клинической практике мазью "Ируксол" (группа 2).

Исследование сыворотки крови 4 группы животных, леченной мазью "Коллагель", содержащей коллазу, показало отсутствие всасывания белка через раневую поверхность на 3, 5, 8 и 14 сут (чувствительность метода 250 нг коллазы в 1 мл сыворотки крови).

При изучении образцов кожи и подлежащих тканей в области инфицированной раны на 3 и 5 сут с момента начала лечения выявлена одинаковая патогистологическая картина у животных всех групп. Признаки заживления развивались, начиная с 8-го дня. Динамика заживления раны была отчетливо более положительна в группе с применением мази "Коллагель". По сравнению с другими, в четвертой группе грануляционная ткань была более зрелая, содержала на 8 сутки отдельные пучки коллагеновых волокон, а на поверхности раны появлялась однослойная выстилка. Через 14 сут в ранах животных всех групп сформировалась зрелая грануляционная ткань. Полученные результаты показывают, что у крыс 2 и 4 групп эпителизация ран и их заживление шло значительно лучше, чем в 1 и 3 группах.

Таким образом, предлагаемый препарат "Коллагель" является одним из эффективных средств для лечения гнойно-некротических ран и ожогов, применение которого в медицинской и ветеринарной практике расширит спектр используемых лечебных препаратов.

Источники научно-технической и патентной информации:
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М., 1984.

2. Авт. свид. СССР N 1617705, МПК⁵ A 61 K 35/56, опубл. 30.11.91 г.

3. Патент РФ N 2074709, МПК⁵ A 61 K 9/06, опубл. 10.03.97 г. (прототип).

4. Zweiman B., et al. Release of lactoferrin and elastase in human allergie skin reactions//J. Immunol. - 1990. -vol.144, N 10, -p.p. 3953-3960.

5. Ledvina M. Role elastase and elastase-like enzymes in the pathogenesis of some diseases// Sb. ved Pr. Lek Fak Karlovu Univ. Hradcy Kralove, 1988, 31(5), p. 455-472.

6. Doring G. et al. Elastase from polymorphonuclearleucocytes: a regylatory enzyme in immune complecx disease// Clin Exp. Immunol., 1986, v. 64, N 3, p.p. 597-605.

7. Mc. Donald RJ. et al. Neutrophil elastase augments acute edematous injury in isolated rat lungs perfused with neutrophil cytoplasts// Am Rev Respir. Dis, 1989, v.140, N 6, p.p. 1825-1927.

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для лечения гнойно-некротических ран и ожогов у людей и животных. Средство в мазевой форме включает комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, полученной из гепатопанкреаса камчатского краба, анестезирующее вещество, дистиллированную воду, бактериостатик, буферную добавку и основу. В качестве комплекса протеолитических ферментов используют коллазу, а в качестве основы - гель полиэтиленоксида, при следующем соотношении компонентов, мас.%: коллаза 0,01-0,1, анестезирующее вещество 2,0-5,0, буферная добавка 0,05-0,7, бактериостатик 1,0-3,0, дистиллированная вода 4,0-7,0, гель полиэтиленоксида остальное. В качество местного анестезирующего вещества используют тримекаин, в качестве буферной добавки - гидроокись калия, а в качестве бактериостатика - борную кислоту. 1 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Средство для лечения гнойно-некротических ран и ожогов, включающее комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба и основу, отличающееся тем, что средство дополнительно содержит аностезирующее вещество, буферную добавку, бактериостатик и дистиллированную воду, в качестве комплекса протеолитических ферментов используют коллазу, а в качестве основы - гель полиэтиленоксида при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Коллаза - 0,01 - 0,1
Анестезирующее вещество - 2,0 - 5,0
Буферная добавка - 0,05 - 0,7
Бактериостатик - 1,0 - 3,0
Дистиллированная вода - 4,0 - 7,0
Гель полиэтиленоксида - Остальное
2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве анестезирующего вещества используют тримекаин, в качестве буферной добавки - гидроокись калия, а в качестве бактериостатика - борную кислоту.