СРЕДСТВО ДЛЯ ЛИЗИСА КЛЕТОК ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/00 C12N1/06 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ферментных средств широкого спектра действия, используемых в медицине для лечения наружных инфекционных заболеваний, а также в генетике, молекулярной биологии и биохимии в лабораторной практике.

Экзоклеточные бактериолитические ферменты широко распространены в природе. Они обнаружены у бактерий, грибов, насекомых, растений, животных и человека. Бактериолитические ферменты имеют различные функции: защитные функции у высших организмов, завоевание экологической ниши и снабжение клеток энергией у микроорганизмов. Защитные функции осуществляются путем лизиса патогенных микроорганизмов [1] . Субстратом бактериолитических ферментов являются пептидогликаны, входящие в состав клеточных стенок грамотрицательных и грамположительных бактерий, но подавляющее количество бактериолитических ферментов не способны самостоятельно лизировать нативные клетки грамотрицательных бактерий.

Известны ферментные препараты на основе бактериолитических ферментов, лизирующие клетки грамположительных микроорганизмов: лизоцим яичного белка [2]. лизостафин [3] и лизоамидаза [4].

Лизоцим используют в медицине для лечения наружных инфекционных заболеваний. Недостатком лизоцима является то, что он лизирует узкий спектр грамположительных микроорганизмов. Он нестабилен и дорог.

Лизостафин используется только в лабораторной практике для получения внутриклеточного содержимого грамположительных бактерий [5]. Он также недостаточно стабилен при хранении.

Лизоамидаза - комплексный ферментный препарат, содержащий бактериолитические, протеолитические ферменты и полисахарид [4]. Этот ферментный препарат лизирует широкий спектр грамположительных, в том числе антибиотикоустойчивых микроорганизмов. Препарат очень стабилен, так как присутствующий в нем полисахарид стабилизирует активность ферментов. Лизоамидаза, так же как и другие бактериолитические ферменты, не лизирует нативные клетки грамотрицательных микроорганизмов из-за наличия в их клеточной стенке внешней мембраны, которая защищает пептидогликановый слой от действия бактериолитических ферментов лизоамидазы.

Известно, что при совместном действии бактериолитического фермента из бактерии Bacillus subtilis IT-25 и полимиксина B (колистин) наблюдается лизис грамотрицательного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa [6]. Не известно действуют ли указанные вещества на другие грамотрицательные микроорганизмы, не показано использование действия фермента и антибиотика в медицине.

Полимиксин B - антибиотик, действующий на грамотрицательные микроорганизмы - дезорганизует клеточную мембрану, следствием чего является гибель клеток микроорганизмов [7]. Полимиксин B оказывает слабое действие на грамположительные микроорганизмы. Он используется в очень редких случаях при тяжелых инфекциях, вызываемых грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas, так как применение средства связано с большим риском из-за возможного нарушения функции почек. Лизирующего действия на клетки полимиксин B не оказывает.

Средство для осуществления лизиса грамположительных и грамотрицательных бактерий, пригодное для использования в медицине, не известно. Но известно использование лизоцима в сочетании с ЭДТА для лизиса грамположительных и грамотрицательных бактерий [8].

Задачей данного изобретения является создание средства для осуществления лизиса грамположительных и грамотрицательных бактерий, пригодное для использования в медицине.

Технический результат от использования изобретения - одновременный лизис грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Сущность предлагаемого объекта - предложено средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий, включающее лизоамидазу и полимиксин B в эффективном количестве.

Средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов содержит компоненты в следующем соотношении, мкг/мл:
Лизоамидаза - 1000 - 3000,
Полимиксин B - 20 - 50,
Буферный раствор - Остальное
Указанное средство может быть получено двумя способами.

1. К раствору лизоамидазы в 0.01 молярном буферном растворе, pH 8, добавляют раствор полимиксина B в том же буфере до определенной конечной концентрации полимиксина B.

Концентрации лизоамидазы в средстве - от 1000 до 3000 мкг/мл, конечная концентрация полимиксина B - 20 - 50 мкг/мл (156 - 390 Е/мл).

Для получения раствора лизоамидазы растворяют порцию лиофилизированного фермента в буфере.

Раствор полимиксина B готовят непосредственно перед применением путем разведения в буфере порции порошка с активностью 250000 Е/мл.

В качестве буфера могут быть использованы в частности Na-фосфатный и трис-HCl буферы.

2. Порошки лизоамидазы и полмиксина B смешивают в соотношении лизоамидаза: полимиксин B 1000 - 3000 : 20 - 50 (мкг), затем добавляют буферный раствор до 1 мл.

Концентрация лизоамидазы определяется тем, что при значениях меньше 1000 мкг/мл не достигается нужный эффект, а при концентрациях больших 3000 мкг/мл из-за наличия в средстве полисахарида наблюдается стабилизация протопластов, получаемых при лизисе клеток, и как следствие - рост микроорганизмов.

Концентрация полимиксина B определяется тем, что при значениях меньших 20 мкг/мл не достигается нужный эффект, а при концентрациях больших 50 мкг/мл наблюдается ингибирование действия лизоамидазы. Это подтверждается на примере действия лизоамидазы на клетки золотистого стафилококка данными таблицы 1.

Предполагается, что полимиксин B, дезорганизуя внешнюю мембрану, создает для лизоамидазы возможность проникнуть к пептидогликановому слою и разрушить его.

Возможность осуществления предложенного изобретения показана в следующих примерах, но не исчерпывается ими.

Пример 1. Получение средства для лизиса.

К 1 мл раствора лизоамидазы в 0.01 молярном растворе Na-фосфатного буфера в концентрации 3000 мкг/мл добавляют 17 мкл раствора полимиксина B в концентрации 8000 мкг/мл (62500 Е/мл) в том же буфере, конечная концентрация полимиксина при этом будет составлять 40 мкг/мл (312 Е/мл).

Пример 2. Получение средства для лизиса.

3000 мкг лизоамидазы смешивают с 40 мкг полимиксина B, к полученной смеси добавляют 1 мл 0,01 молярного трис-HCl буфера, pH 8.0.

Пример 3. Лизис условно патогенных лабораторных штаммов бактерий.

К 2 мл микробной взвеси в 0,01 М Na-фосфатном буфере, pH 8,0 (оптическая плотность 0,7 при длине волны 590 нм) добавляют 500 мкл раствора средства, содержащего лизоамидазу и полимиксин B, полученного в примере 1.

Смесь инкубируют 30 минут при 37 град. С. Реакцию останавливают добавлением насыщенного раствора хлористого натрия.

За единицу бактериолитической активности принимают такое количество фермента, которое приводит к снижению оптической плотности бактериальной суспензии на 0,01 оптическую ед. в 1 мин.

В качестве контроля вместо предлагаемого средства используют 500 мкл раствора лизоамидазы в буфере в концентрации 3000 мкг/мл или 500 мкл полимиксина B в буфере в концентрации 40 мкг/мл (312 Е/мл) или в концентрации 80 мкг/мл (625 Е/мл).

Данные, представленные в таблице 2, подтверждают, что предложенное средство может быть использовано для лизиса грамотрицательных бактерий.

Пример 4. Лизис патогенных штаммов бактерий.

К 1 мл взвеси микробных клеток в 0,01М Na-фосфатном буфере pH 8,0 в стерильных пробирках добавляют стерильно:
1,5 мл раствора лизоамидазы с полимиксином B в том же буфере (конечная концентрация лизоамидазы 1000 мкг/мл (10 ЛЕ/мл), конечная концентрация полимиксина - 40 мкг/мл (312 Е/мл).

Полученную смесь инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 24 часов. Затем делают десятикратные разведения и высевают на чашки со средой Луриа-Бертани [8] по 0,1 мл из каждого разведения.

После инкубации чашек в термостате проводят учет результатов. Положительным (+) считают результат, когда при высеве на чашки из пробирок, содержащих 10 - 10 клеток/мл, наблюдают отсутствие роста колоний. Отрицательным (-) - в случае роста колоний. Количество микробных клеток в исходной взвеси определяют, используя контрольный вариант, в котором вместо предлагаемого средства к микробной взвеси добавляют стерильный буфер.

В качестве контроля вместо средства, содержащего лизоамидазу и полимиксин B, используют:
1,5 мл раствора лизоамидазы в том же буфере в конечной концентрации 1000 мкг/мл (10 ЛЕ/мл);
1,5 мл 0,01 М трис-HCl буфера, pH 8,0.

Данные представлены в таблице 3.

Полимиксин B не использовали в данном примере в качестве контроля в связи с тем, что после действия предлагаемого средства на клеточную суспензию визуализизацию количества нелизированных клеток проводят методом их инкубации на твердой питательной среде. Известно, что полимиксин B подавляет рост грамотрицательных микроорганизмов и их нелизированные при инкубации в жидкой среде с полимиксином B клетки не прорастают в присутствии полимиксина B на твердой питательной среде. Положительный эффект действия самого полимиксина B связан не с лизисом клеток, а с подавлением их роста.

Пример 5. Применение лизоамидазы с полимиксином B для лечения заболеваний периодонта.

Лизоамидазу с полимиксином B использовали для лечения 25 больных с хроническим фиброзным, гранулематозным, гранулирующим периодонтитом и хроническим периодонтитом в стадии обострения. В первые 3 - 5 часов после обработки корневых каналов у пациентов исчезали боли, уменьшалась гиперимия и отек слизистой оболочки. Герметизация корневых каналов с препаратом под временной пломбой переносилась безболезненно. В течение месяца полностью исчезали свищевые ходы. Клинико-рентгенологический контроль отдаленных результатов лечения воспалительных процессов в периодонте показал, что полное и частичное восстановление костной ткани у верхушки зуба отмечается в 89%.

Таким образом показано, что предлагаемое средство, включающее лизоамидазу в сочетании с полимиксином B, способно лизировать клетки представителей как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, в том числе и патогенных, способных вызывать серьезные инфекционные заболевания: в частности заболевания полости рта.

Литература
1. Imoto T., Johnson L.N., North A.C.T., Phillips D.C. and Rupley J.A. In The Enzymes, 1972. Academic Press, New York, London, pp. 665 - 868.

2. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. 1979, "Высшая школа", стр. 347 - 349.

3. Schindler C.A., Schuhardt V.T. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the Staphylococcus. 1964, Proc. of the Nation. Acad. Sci. USA, v. 51, N 3, pp. 415 - 421.

4. Кулаев И. С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. В сборнике: "Бактериолитический препарат лизоамидаза. Физиологические, биохимические и клинические аспекты", 1989, Пущино, стр. 3 - 9.

5. Mulder R.R., Brennen C., Wagener M.M., Viskers R.M., Rihs J.D., Hancock G.A., Yee Y.C., Miller J.M., Yu V.J. Methicillin-Resistant Staphylococcal Colonization and Infection in a Long-Term Care Facility. Annals of Internal Medicine, 1991, v. 114, N 2, pp. 107 - 112.

6. Takahara, Y. Hurose, N. Yasuda, K. Mitsugi, S. Murao. Effect of peptidolipids produced by Bacillus on the enzymatic lysis of Gram-negative bacterial cells. 1976, Agr. Biol. Chem., v. 40, N 9, pp. 1901-1903.

7. Франклин Т. , Сноу Дж. Биохимия антимикробного действия. 1984, М., "Мир", стр. 78 - 80.

8. Osborn M. I. , Munson R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of gram-negative bacteria. 1974, Meth. Enzymol., v. 31, p. 642 - 653.

9. Девис Р. , Ботстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. М.: Мир, 1984, стр. 142.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ферментных средств широкого спектра действия, используемых в медицине для лечения наружных инфекционных заболеваний, а также в генетике, молекулярной биологии и биохимии в лабораторной практике. Предложено средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включающее лизоамидазу, полимиксин В и буферный раствор при следующем соотношении компонентов, мкг/мл: лизоамидаза 1000-3000, полимиксин В 20-50, буферный раствор остальное. Предлагаемое средство способно лизировать клетки представителей как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, в том числе и патогенных, способных вызывать серьезные инфекционные заболевания, в частности заболевания полости рта. 3 табл.

Средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включающее ферментный препарат, содержащий фермент, лизирующий грамположительные микроорганизмы, и вещество, нарушающее структуру мембран грамотрицательных микроорганизмов, отличающееся тем, что в качестве ферментного препарата оно содержит лизоамидазу, а в качестве вещества, нарушающего структуру мембран грамотрицательных микроорганизмов, - полимиксин В и дополнительно буферный раствор при следующем соотношении компонентов, мкг/мл:
Лизоамидаза - 1000 - 3000
Полимиксин В - 20 - 50
Буферный раствор - Остальное