vj
ел
-pib Изобретение относится к микробиологической промышленности, производящей ферментные препараты, и может быть использовано в фармацев тической и медицинской промьпЕпеннести. Фермент может найти широкое при нение при борьбе с инфекционными заболеваниями, вызванными грамнпол жительной микрофлорой. Наиболее распространенными продуцентами фермента литического действия .являются различные виды бактерий, например, Achromobacter lunatur СО, Flavobacterium L2j, Bacillus cereus Гз и др. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту из известных штаммов является Pseudomonas aeruginosa L, процес культивирования которого ведут в течении 72 ч при 30°С, рН7,4 в ср де, содержащей 2-5% нормальных пар финов (С 0,6% мочевины, 0,05% , 0,05% NaHjPO,0,05 MgSO, 0,1% дрожжевого экстра та, 10 мкг/мл FeSO, 10 мкг/мл CaC Для осаждения литического фермента используют сульфат аммония (80% насыщения) или этанол в- соотношении 3:1. Полученньй таким обра зом литический препарат лизирует следующие микроорганизмы; псевдомо нады, микрококки, стафилококки, батдиллы. Бактериолитическая активность фермента составляет 20-80% лизиса тест-культура в 1 ч. OcHOBHbiNr общим недостатком кзвсстньсх штаммов является их низкая активность. Кроме того, велико время культи вирования штаммов продуцентов, а п л чаемый препарат не лизирует штам мы следуюш х родов микроорганизмов Streptococcus, Chromobacterium, Flavobacterium, Kurthia, Sarcina, .Neisseria. Целью изобретения является штам Pseudomonas lytica ВКМ В-1454Д, об ладаю ций высокой литической активностью. Поставленная цель достигается использованием в качестве продуцен та литического препарата неописаннего ранее штамма Pseudoroonas lyti ВКМ В-1454 Д, выделенного из воды реки Оки в ареале максиальнс го распространения микроорганизмов, лизирующих стафилококки. Штамм Pseudomonas lytica ВКМ В-1454 Д характеризуется следуюш 1ми свойствами: Морфологические и культуральные признаки; Грам.отрицательные палочки, не образующие спор. О, 5-0,83-5 мкм, слегка искривленные монотрихи, клетки подвижные. Колонии на МПА бесцветные, с ровным краем, при старении слегка морш 1нистые в центре. При росте в МПБ образуют осадок, муть, пленку. Флуоресцирующий пигмент не продуцирует. Физиолого-биохимические свойства, Строгий аэроб, растет при температуре от 4 до 37°С, не растет, при , оптимальная температура . Метаболизм глюкозы дыхательный. В качестве источника углерода ис-пользует арабинозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и ацетат натрия. Не использует ксилозу, фруктозу, рамнозу, лактозу, рафинозу, соли щавелевой, молочной, яблочной, лимонной и глутаминовой кислот, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит, инулин. Не ну-ждается в факторах роста. Способна расти на минеральной среде без факторов роста. Оксидазная и каталазная активности - положительные. Не образует хитиназу, целлюяазу, уреазу, сероводород, индол. .Гидролизует крахмал. Не разжижает желатину. Пептонизирует молоко. Редуцирует нитраты. Не обладает липолитической ак- . тивностью (40, 60, 80- твины) . Аргининдигидродаза отсутствует. Процентное содержание Г+Ц 59,5%. Хранится на МПА, из-за энергичного автолиза требует пересевов через 7-10 суток. Штамм Pseudomonas lytica хранится, не теряя жизнеспособности и активности, под слоем вазелиноБого масла или в лиофильно сухом состоянии. . При росте на твердой среде, содержащей стафилококк, образует крупные зоны лизиса вокруг своих колоний. 310757 Новый штамм выделен из воды реки Оки в ареале максимального распростр.анения микроорганизмов, лизирующих стафилококки. На основе морфологических, куль- j туральных и физирлого-биохимических свойств новый штамм согласно определителю Берги 8-го издания, относится к роду Pseudomonas. Излучение свойств нового штамма 10 не позволяет отнести его ни к одному из 26 видов рода Pseudomonas, представленных в определителе. По ряду свойств: способности расти на минеральной среде без факторов роста, составу Г+Ц, способности к денитрификации и росту при , наиболее близок к виду Pseudomonas cichorii. Однако от этого вида ее отличает способность гидролизовать крахмал 20 и неспособность образовывать флуорес- . цирующий пигмент. На основании этого культуре дано видовое название Pseudomonas lytica. Продуцент литического препарата 25 Pseudomonas lytica .ВМК В-1454Д вы- . ращивают всреде, содержащей 0,0080,012% дрожжевого экстракта, 0,060,08% казаминовых кислот, 0,51,5 мг/мл автоклавированных, лиофиль- зо но высушенных клеток стафилококка при рН среды 8,0-8,3, культивирование проводят в течение 18-20 ч при 22-25С. Выделяют целевой продукт после отделения клеток от культуральной жидкости известными методами,
За единицу литической активности (Е/мл) принято такое количество фе;рмента, которое вызывает падение оптической плотности суспензии живых или автоклавированных клеток тест - организма (Staphylococcus aureus) в 0,01 М фосфатном буфере, рН 8,5, на 0,01 оптическую единицу в 1 мин. Удельную литическую активность (Е/мг) рассчитывают как отношение активности фермента к количеству белка в том же объеме. I
Литическое действие препарата проверяли на живых и прогретых (80°С в течение 20 мин) клетках 38 видов грамположительных бактерий, 3 видов нокардий, 4 видов микробактерий, 27 видов грамотрицательных микроорганизмов и 19 видов дрожжей из коллекции культур ИБФМ АН СССР, а также на клетках 133-Х штаммов 15
Staphylococcus
aureus- -B-83
Менее интенсивньш лизис наблюдался под действием фермента на некоторые виды флавобактерий, а также на Kurthia zpphf11 В-183 и на хромобактерии. С высокой скоростью препарат лизировал прогретые клетки многих грамположительных, так и многих грамотрицательных организмов. 1
Препарат показал высокую активность в отношении всех опробованных штаммов стафилококков и микрококков вьщеленных от больных. Менее эффективно препарат действовал на стрептококки групп В и Д, а также на некоторые стрептококки группы А.
Грамотрицательные патогенные микроорганизмы, за исключением Neisser оказались устойчивыми к действию фермента. . .
Приме р. Штамм Pseudomonas lytica В-1454 Д выращивают в жидкой среде, содержащей 0,01% дрожжевого экстракта (Difсо), 0,06% казаминовы 0 атогенных микроорганизмов из колекции Государственного, научносследовательского института станартизации и контроля медицинских иологических препаратов МЗ СССР м. Л.А. Тарасевича. Результаты проведенных исследоаний представлены в табл. 1 и 2. Из таблицы видно, что литический препарат из культуральной жидкости нового штамма Pseudomonas lytica активен в отношении клеток грамположительных микроорганизмов: Arthrobacter globiformis А. citreus А. cristallopoietesА. tumescens Bacillus firmus Mucrococcus luteus Sarcina aurantiaca
кислот (Difсо), 1,0 мг/мл автоклавированных лиофильно высушенных клеток Staphylococeus aureus при рН 8,3 20-24 ч при 24°С на качалке в 100 МП среды в медицинских колбах объемом 750 мл. Клетки отдаляют центрифугированием на холоду при 6200 g в течение 40 мин.
К полученному прозрачному супернатанту добавляют разбавленную уксусную кислоту до установления рН 6,7 и раствор MgCl до конечной концентра.ции .
. Обработанный вышеописанным способом супернатант наносят на колонку 2, см с гидроксилаппатитом (Мазин А.Л., Сулимова Г.Е., Биохимия, 1975, т. 40, вып. 1). После нанесения колонку промывают 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 10 MgCl. Десорбцию ведут натрий-фосфатным буфером рН 6,8, образующим градиент молярности от 0,01 до 0,15 М, Максимальная литическая активность элюируетс при концентраики буфера 0,08-0,1 М
Полученньш таким образом препарат имеет удельную активность 10001500 Е/мг,
Физико-химические характеристики литического препарата.
Температурный оптимут 1 препарата 45-50°С.
Оптимум рН - 8,5
Оптимум молярности фосфатного буфера 0,01 М.
Действие литического препарата из культуральной жидкости Pseudomonas lytica на различные микроорганизмы (коллекция культур ИБФМ АН СССР)
Препарат стабилен при температуре ниже 40С и инактивируется при 15-минутном прогреве при .
Таким образом, преимущество предлагаемого штамма по сравнению с известным заключается в том, что активность получаемого препарата значительно выше, чем известного. Так, например, лизис тест-культуры Staphylococeus aureus получаемым препаратом из Pseudomonas lytica протекает на 100% в течение 5 мин, в
то время как из Pseudomonas aerugiпоза лизис Staphylococeus aureus протекает на 86,4% за 1 или 4 часа.
Фермент обладает иным спектром литического действия. В известном
20 техническом решении препарат лизирует представителей родов Staphylococeus, Micrococcus, Bacillus, Corynebacteriuin, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus, Erwinia,
25 Arthrobacter, Achromobacter, Aeromonas, Kanthomonas.
Получаемый препарат лизирует интактные клетки представителей
30 родов Staphylococeus, Micrococcus, Arthobacter, Chromobacterium, Bacillus, Streptococcus, Flavobacterium, Kurthia, Sarcina, Neisserid.
Кроме того, почти все исследован- 5 ные тест-организмы лизируются препарат-ом после их прогревания при 80°С (см. табл. 1).
Та б л и
ц а 1
ШТАММ PSEUDOMONAS LYTICA. ВКМ В-1454 Д (Всесоюзная коллекция культур микроорганизмов при Институте .биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1454Д) -продуцент литического фермента. (Л с:
В-126
ИБФМ В-151
В-52
92
- - 90 88
96
94 92
94
97
94 97
100
97
и
12
1075740
.Продолжение табл, 1 Rhodotorula aurantiaca . R. glutinus. Zygosaccharomyces thermotoleransY-511 Candida utilis Y-105 CryptococcuslawrentiaCryptococcus albus var BKM 1540 terreug Torulopsis magnoliae Y-429 Nadsonia Y-289 fulvescens Pichia membranae faciens Y-292 Rhodotorula glutinus Y-319 Saccharomyces cerevisiae Y-357 Saccharomyces carlsbergensis Y-335 ShizosaccharoY-393rayces pombe 25 30 22 25 2126 00 00 00 7,0 8,0 0 12,2 16,5 22 25 12,5 17,8 00 00
Продолжение табл . 2
444 8172
S 546 Некоторые штаммы обозначаются фамилией выделены.
О О
120 120
420 больного, от которого они были
