СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 2004 года по МПК C12P19/04 A61K39/02 A61K39/39 G01N33/53 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выделения липополисахаридов из микробной массы, и может быть использовано для производства химических вакцин, иммуномодуляторов и конструирования диагностических тест-систем.

Известны различные способы получения липополисахаридов (ЛПС): водно-фенольный способ, способы экстракции клеток водно-эфирной смесью и трихлоруксусной кислотой (Захарова И.М., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка, 1982).

Недостатками указанных способов являются невысокая степень очистки получаемых ЛПС за счет присутствия в препаратах примесей других бактериальных компонентов и продолжительность процедур выделения.

Известен также способ получения бактериальных липополисахаридов (Патент РФ № 2051969, МПК С 12 Р 19/04), включающий культивирование микробной массы, отделение бактериальных клеток, обработку их водно-фенольной смесью, сбор водной фазы центрифугированием и очистку целевого продукта от примесей нуклеиновых кислот, при этом водную фазу при 0-4°С обрабатывают детергентом Тритон Х-114 в конечной концентрации 6%, разделяют водную и детергентную фазы при 37°С, собирают детергентную фазу, осаждают целевой продукт ацетоном, отделяют осадок центрифугированием, промывают его ацетоном, растворяют в дистиллированной воде и лиофилизируют.

Однако данный способ характеризуется многоступенчатой процедурой очистки, что затрудняет процесс получения чистого ЛПС.

Наиболее близким к заявляемому является способ выделения ЛПС, получивший наибольшее распространение в аналитической практике (Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopoiysaccharide chemotypes in silverstained polyacrylamide gels // J.Bacteriol. 1983. V.154. P.269-277). Способ основан на обработке протеиназой К предварительно лизированных бактерий и включает следующие этапы: культивирование бактерий, отделение их от среды культивирования с помощью центрифугирования, разрушение (лизис) бактерий путем кипячения в течение 10 мин в 1М Трис-НСl буфере рН 6.8, содержащем 2% додецилсульфата натрия и 4% меркаптоэтанола, и обработку протеолитическим ферментом протеиназа К (0.0625 мкг фермента на 50 мкл лизированных бактерий) в течение 60 минут при температуре 56-60°С.

Недостатком способа является наличие этапа разрушения бактериальных клеток в присутствии детергента - додецилсульфата натрия, что усложняет процедуру получения ЛПС. При этом используемый детергент является трудноудалимой примесью, снижающей качество получаемых препаратов.

Задачей изобретения является упрощение способа получения липополисахарида при улучшении его качества.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения липополисахаридов, включающем культивирование бактерий, осаждение их из среды культивирования центрифугированием, обработку протеолитическим ферментом протеиназа К до получения липополисахаридов, согласно предлагаемому решению после осаждения бактерий из их наружных мембран экстрагируют высокомолекулярный комплекс, состоящий из липополисахарида и белка путем добавления к бактериям раствора, содержащего ЭДТА в количестве 0.01-0.05 ммоль на 1 г влажных клеток, затем центрифугированием отделяют от бактерий полученный экстракт, который и подвергают обработке ферментом.

В сравнении со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет упростить процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных клеток в присутствии додецилсульфата натрия, что обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в получаемом препарате ЛПС.

Изобретение поясняется фигурой, демонстрирующей электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле (ПААГ) препарата ЛПС, полученного заявляемым способом.

Способ осуществляют следующим образом.

Бактерии выращивают на соответствующей питательной среде при оптимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста, отделяют их от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагируют из них комплекс, состоящий из липополисахарида и белка, путем добавления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТА в количестве 0.01-0.05 ммоль на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяют от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляют к нему протеолитический фермент протеиназа К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Полученную смесь инкубируют в течение 60 мин при температуре 56-60°С. В результате обработки ферментом ЛПС остается единственной макромолекулой в растворе. ЛПС в растворе может быть использован в аналитической практике. Кроме того, для производства химических вакцин и иммуномодуляторов ЛПС может быть выделен из раствора с помощью любой стандартной процедуры осаждения.

Пример 1.

В качестве объекта выделения ЛПС использовали бактерии Azospirillum brasilense. Бактерии выращивали на жидкой синтетической малатной среде при 30°С в течение 18 часов, отделяли их от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагировали из них комплекс, состоящий из липополисахарида и белка путем добавления к клеточной массе буферного раствора следующего состава: 0.1 М Трис-HCl, 2 ммоль ЭДТА, 0.1 ммоль фенилметилсульфонил хлорид, 1% Тритон Х-100, рН 8.0. Количество ЭДТА на 1 г влажных бактериальных клеток составляло в этом случае 0.01 ммоль. Экстракт отделяли от клеток с помощью центрифугирования и добавляли к нему протеиназу К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Полученную смесь инкубировали в течение 60 мин при температуре 56-60°С.

Пример 2.

Получение ЛПС проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 1, при этом использовали другой экстрагирующий буферный раствор, содержащий 0.1 М HEPES, 6 ммоль ЭДТА, 0.1 ммоль фенилметилсульфонил хлорид, 1% Тритон Х-100, рН 7.8. Количество ЭДТА на 1 г влажных бактериальных клеток составляло 0.03 ммоль.

Пример 3.

В качестве объекта выделения ЛПС использовали бактерии Escherichia coli, которые выращивали на жидкой среде, содержащей триптон и дрожжевой экстракт при 37°С и интенсивной аэрации в течение 18 часов. Получение ЛПС осуществляли по методике, описанной в примере 1, при этом экстрагирующий буфер содержал 10 ммоль ЭДТА. Количество ЭДТА на 1 г влажных клеток составляло в этом случае 0.05 ммоль.

Полученный заявляемым способом препарат ЛПС демонстрирует более четкое разделение в электрофорезе, что доказывает более высокое качество этого препарата по сравнению с прототипом. Выделенный описанным способом препарат может быть использован не только в электрофоретических экспериментах, но и в широком наборе микробиологических, биохимических и иммунологических исследований, а также для получения иммуномодулирующих препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам выделения бактериальных липополисахаридов, и может быть использовано для производства химических вакцин, иммуномодуляторов и конструирования диагностических тест-систем. Экстракцию липополисахаридов проводят буферным раствором, содержащим ЭДТА в количестве 0,01 – 0,05 ммоль на 1 г влажных клеток, 0,1 ммоль фенилметилсульфонил хлорид и 1% Тритон Х-100. Полученный экстракт отделяют от бактерий центрифугированием и подвергают обработке ферментом протеиназой К. Изобретение позволяет значительно упростить способ получения липополисахаридов при улучшении качества препарата. 1 ил.

Способ получения липополисахаридов, включающий культивирование бактерий, осаждение их из среды культивирования центрифугированием, проведение экстракции липополисахаридов и обработку экстракта протеиназой К с последующим получением липополисахаридов, отличающийся тем, что экстракцию проводят буферным раствором, содержащим ЭДТА в количестве 0,01–0,05 ммоль на 1 г влажных клеток, 0,1 ммоль фенилметилсульфонилхлорид и 1% Тритон Х-100, а полученный экстракт отделяют от бактерий центрифугированием.