МАТРИЦА ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/551 G01N33/552 G01N33/533 B01J20/02 B01J20/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний.

Известны иммунные сорбенты, в которых антитела присоединяются к матрице при помощи ковалентных связей (Патент США N 4614513, 1986). При этом эффективность связывания сорбента с искомыми клетками остается невысокой за счет низкой емкости загрузки антител на единицу матрицы.

Известны магнитные иммунные сорбенты, у которых присоединение антител к сорбенту происходит за счет сорбционного связывания (Патент США N 4018886, МКИ² G 01 N 21/46, 1977). Такие связи являются неустойчивыми, так как может происходить десорбция антител.

Известны иммунные сорбенты в виде магнитных альбуминовых микросфер (Патент США N 4582622, МКИ⁴ H 01 F 1/00, 1986). Для их получения используют формальдегид и глутаровый альдегид, которые могут повреждать иммуноглобулины. Сорбент обладает невысоким удельным связыванием (от 1 до 3 мг). Кроме этого, процедура получения сорбента представляет собой довольно сложный процесс.

Известен иммуносорбент, содержащий железо и оболочку из SiO₂ (ЕР 0240770, МКИ⁵ G 01 N 33/553, 1987).

Задачей настоящего изобретения является повышение удельной емкости связывания на единицу массы сорбента и прочности его связывания с антителами при одновременной высокой намагниченности сорбента.

Поставленная задача достигается использованием в качестве матрицы композитных феррочастиц, состоящих из 80-95% железа, 1-16% оксида кремния и 0,5-4% оксида титана.

Феррочастицы синтезируются с помощью плазмохимического метода.

Содержанием железа определяется магнитоуправляемость сорбента. Увеличение процентного содержания железа более 50% ведет к увеличению намагниченности сорбента. Намагниченность насыщения таких феррочастиц составляет 70-80 emu/g, что позволяет проводить эффективное концентрирование феррочастиц в неоднородных магнитных полях, создаваемых постоянными магнитами из сплавов самарий-кобальт или неодий-железо-бор.

В настоящее время такие магниты производятся в значительных объемах и доступны по цене.

Включение в состав феррочастиц SiO₂ обеспечивает высокую удельную загрузку сорбента антителами.

Включение TiO₂ в феррочастицы обеспечивает прочную и стабильную фиксацию антител.

Феррочастица представляет собой образование сферической формы, ядро которого состоит из железа и покрыто оболочкой из SiO₂ и TiO₂.

Для получения предлагаемого сорбента используют маталлохелатный способ (Иммобилизованные клетки и ферменты. Под ред. Дж. Вудворда. - М.: Мир, 1988. -С. 31-35).

Один грамм композитного порошка, состоящего из железа и оксида кремния, вносят в колбу и добавляют 100 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы подвергают воздействию ультразвука и добавляют 0,2 мл хлорида титана при непрерывном перемешивании в течение 30 минут. Модифицированный порошок отмывают от избытка хлорида титана не менее 5 раз и добавляют раствор иммуноглобулинов. Полученную смесь инкубируют в течение 60 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени удаляют из раствора неконъюгированные антитела с помощью центрифугирования. В полученный раствор иммуномагнитного сорбента добавляют консервант (например азид натрия) и хранят препарат иммуномагнитного сорбента при температуре +4^oC. При использовании металлохелатного способа была достигнута фиксация 80 мг иммуноглобулинов на 1 г носителя. Для сравнения, сорбционное связывание позволяет фиксировать не более 10 мг белка или иммуноглобулинов на 1 г массы полистироловых или силикагелиевых мелкодисперсных частиц.

Использованная методика связывания иммуноглобулинов не приводит к их повреждению с сохранением специфической активности антител и обеспечивает их прочную фиксацию (на уровне химической связи).

Размер частиц иммуномагнитного сорбента в фосфатном буфере с pH 7,4 лежит в интервале 2-5 мкм.

Иммуномагнитный сорбент, синтезированный с использованием антител к микобактериям туберкулеза (штамм H₃₇R_v), полученных из сыворотки иммунизированных кроликов, был апробирован в экспериментах по селективному концентрированию микобактерий туберкулеза из клеточных суспензий и в клинических условиях.

Иммуномагнитный сорбент (далее Микосорб) добавляли в клеточную суспензию или клинический материал (мокроту), проводили их совместное инкубирование в течение 30 минут и концентрировали микобактерии, связавшиеся с Микосорбом с помощью магнита или центрифугирования. Из полученного осадка делали мазок на предметном стекле и производили стандартную процедуру обработки мазка для люминесцентной микроскопии. Эксперименты на клеточных суспензиях микобактерий туберкулеза (МБТ) с использованием Микосорба позволили выявлять МБТ из суспензий МБТ с концентрацией 10 клеток в см³ в то время как стандартная методика позволила обнаруживать клетки из клеточных суспензий с концентрацией не менее 1000 кл/см³. Применение Микосорба в клинических условиях позволило увеличить выявляемость микобактерий туберкулеза в мокроте пациентов на 80%. Было обследовано 128 образцов мокроты от различных пациентов.

Препарат Микосорб сохраняет свои свойства в течение не менее 6 месяцев.

Полученный магнитоуправляемый иммуносорбент тестировали на способность концентрировать клетки микобактерий туберкулеза (штамм H₃₇R_v) во время его хранения. Тестирование проводили по следующей методике. В пластиковые конические пробирки объемом 50 мл вносили суспензию клеток МБТ с концентрацией 10³, 10², 10 организмов в 1 мл. В каждую пробирку добавляли по 250 мкл иммуномагнитного препарата. Исходная концентрация иммуномагнитного препарата 2,5 мг/мл (625 мкг). В пробирку помещали на встряхиватель и проводили инкубацию в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки, конъюгированные с иммуносорбентом, концентрировали в неоднородном магнитном поле в специальном магнитном штативе. Напряженность магнитного поля на поверхности постоянных магнитов составляла 2500 рст. Полученный осадок наносили на предметное стекло и готовили препараты для люминесцентной бактериоскопии по стандартной методике. Бактериоскопию проводили на люминесцентном микроскопе. Результаты анализа выявленных МБТ в мазках с использованием свежеприготовленного иммуносорбента и со сроком хранения 3 и 6 месяцев представлены в таблице и показывают, что магнитоуправляемый сорбент сохраняет свои свойства.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний. Предложена матрица иммуномагнитного сорбента в виде частиц сферической формы с размером 2-5 мкм, содержащая следующие компоненты, мас. %: железо 80-95, оксид кремния 1-16, оксид титана 0,5-4. Изобретение позволяет получить высокую емкость сорбента и высокую намагниченность. 1 табл.

Матрица иммуносорбента сферической формы, содержащая железо и оксид кремния, отличающаяся тем, что матрица дополнительно содержит оксид титана при следующем содержании компонентов, мас.%:
Железо - 80 - 95
Оксид кремния - 1 - 16
Оксид титана - 0,5 - 4
при этом размер частиц составляет 2 - 5 мкм.