СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 C12Q1/16 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, микробиологии.

Известен способ определения микробактерий туберкулеза в диагностической пробе. Авторское свидетельство СССР 1684616 от 31 марта 1989 г.

Способ существляется следующим образом: диагностический материал гомогенизируют в присутствии 10% раствора Na₃PO₄ при интенсивном встряхивании со стеклянными бусами в течение 30 мин. Гомогенат нейтрализуют соляной кислотой до рН 7,0. К обработанному материалу добавляют взвесь феррочастиц, полученных плазмохимическим способом, с размером частиц 50-100 Å и удельной поверхностью 100-130 м²/г. Гидрозоль феррочастиц получают в фосфатно-солевом буфере непосредственно перед исследованием путем ультразвуковой обработки суспензии феррочастиц в течение 3-5 мин на стандартном ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Е при частоте колебания 22 кГц и мощности излучения 80-100 Вт/см². Озвученную ферросуспензию инкубируют при комнатной температуре с гомогенизированным материалом в течение 60 мин при встряхивании. Пробирку с исследуемым материалом помещают на 10-15 мин в поле постоянного магнита размером 40×40×10 мм, выполненного из сплава самарий-кобальт с напряженностью на поверхности 10³-2×10³ Э и градиентом поля от 500 до 1000 Э на см. Полученный осадок наносят на предметные стекла в виде мазков, которые фиксируют при 80°С в течение 60 мин. Мазки окрашивают люминесцентным красителем на основе аурамина и родамина С, обесцвечивают 3% раствором соляной кислоты на 70% этаноле, докрашивают 0,025% раствором метиленового синего. Микроскопию мазков проводят на микроскопе ЛЮМАМ и определяют флюоресцирующие золотисто-желтые микробные палочки при просмотре не менее 100 полей зрения.

Недостатком способа является дополнительный этап идентификации бактериальных клеток.

Техническим результатом осуществления изобретения является выделение бактериальных клеток из диагностического материала с одновременной их идентификацией.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пробу диагностического материала гомогенизируют одним из двух способов. Если материал представляет собой биологическую жидкость (кровь, моча, мокрота и т.п.), то его помещают в стандартную пробирку из полимерного материала объемом 50 мл, добавляют равный объем раствора для разжижения, приготовленного непосредственно перед употреблением из равных частей гидрокснда натрия и цитрата натрия, и перемешивают материал в течение 30-60 с. Если материал разжижается плохо, добавляют порошок N-ацетил-L-цистеина из расчета 20-70 мг на образец в зависимости от его вязкости. Образец нейтрализуют, добавляя равный объем раствора фосфата натрия, в 1 л которого содержится 40 мг фенолового красного, служащего индикатором нейтрализации.

Если материал представляет собой тканевый биоптат, то он растирается в ступке со стерильным речным песком, после чего его помещают в стандартную пробирку из полимерного материала объемом 50 мл и добавляют к нему раствор для разжижения, приготовленный непосредственно перед употреблением из равных частей гидрокснда натрия и цитрата натрия, в соотношении 1:3, с добавлением N-ацетил-L-цистеина в количестве 100 мг. Для достижения хорошей степени гомогенизации исследуемый материал неинтенсивно перемешивают на шейкере, помещенном в термостат с температурой 37°С, в течение 3 ч. Далее образец центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 15 мин, супернатант частично удаляют, а осадок с остатком супернатанта нейтрализуют добавлением равного объема раствора однозамещенного двухводного фосфата натрия, на 1 л которого в качестве индикатора рН добавляют 40 мг фенолового красного. О нейтрализации образца свидетельствует изменение окраски раствора от малиновой к оранжевой. К нейтрализованному одним из описанных способов материалу добавляют 0,1 мл суспензии, содержащей ферромагнитные микрочастицы, на поверхности которых закреплены иммуноглобулины к соответствующим возбудителям бактериальных инфекций, и неинтенсивно перемешивают в течение 50-60 с. Ферромагнитные микрочастицы в виде ультрадисперсного порошка получают, например, плазмохимическим методом, они имеют форму, близкую к сферической, содержат 20-25% оксида кремния, при этом ядро их состоит из железа. При получении ферромагнитных микрочастиц им придают свойство радиоактивности. После этого на поверхности частиц металлохелатным или стрептовидиновым способом прочно фиксируются иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови животных-продуцентов, предварительно, с целью получения высоких титров антител, гипериммунизированных аттенуированными штаммами соответствующих возбудителей бактериальных инфекций или инактивированными бактериями. Данные способы позволяют фиксировать до 80 мг иммуноглобулинов на 1 мг носителя. Суспензию ферромагнитных микрочастиц в фосфатно-солевом буфере получают непосредственно перед проведением исследования путем обработки на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Е в течение 3-5 мин при частоте колебания 22 кГц и мощности излучения 80-100 Вт/см². После добавления суспензии ферромагнитных частиц с закрепленными иммуноглобулинами материал инкубируют при комнатной температуре, неинтенсивно перемешивают на шейкере в течение 30-60 мин, а затем осаждают в течение 20-30 мин, помещая пробирку в магнитный штатив со встроенными блоками постоянного магнита.

После подготовки диагностического материала в пробирку вводят магнитный зонд-пробоотборник, имеющий сердечник из постоянного магнита и сменный немагнитный наконечник, на поверхности которого зафиксированы иммуноглобулины, аналогичные зафиксированным на поверхности ферромагнитных микрочастиц. Под действием магнитного поля сердечника зонда-пробоотборника к поверхности наконечника притягиваются все введенные в образец ферромагнитные микрочастицы. При этом на его поверхности фиксируются только частицы, образовавшие комплекс с бактериальной клеткой, что происходит за счет неиспользованных связей клетки с иммуноглобулинами. Остальные частицы удерживаются у поверхности наконечника только за счет действия магнитного поля. Далее зонд-пробоотборник переносят в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость и создают вихревые потоки жидкости. На дне отмывочной емкости установлен постоянный магнит. После извлечения магнитного сердечника все ферромагнитные микрочастицы, не связанные с бактериальными клетками и через них - с поверхностью наконечника, отделяются от нее потоками жидкости и под действием магнитного поля собираются на дне отмывочной емкости.

Извлеченный из отмывочной емкости наконечник зонда-пробоотборника, на поверхности которого закрепились ферромагнитные частицы, обладающие радиоактивностью и связанные с соответствующими бактериальными клетками, переносятся к устройству, регистрирующему радиоактивное излучение, по наличию которого делается вывод о том, что из диагностического образца выделены бактериальные клетки, являющиеся возбудителями соответствующего инфекционного заболевания.

Технический результат достигается тем, что при получении ферромагнитных микрочастиц им придают свойство радиоактивности, а в полученный осадок ферромагнитных микрочастиц вводят магнитный зонд-пробоотборник со сменным немагнитным наконечником, на поверхности которого зафиксированы иммуноглобулины, аналогичные зафиксированным на поверхности ферромагнитных микрочастиц, после чего наконечник помещают в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость, с постоянным магнитом на дне, а у отмытого наконечника определяют наличие радиоактивности с помощью устройства, регистрирующего радиоактивное излучение.

Пример 1. Исследования мокроты больного туберкулезом.

К образцу мокроты (20 мл) добавили равный объем раствора, приготовленного ex tempore из 4% раствора гидроксида натрия и 4% раствора трехзамещенного цитрата натрия. Исследуемый материал перемешивали в течение 60 с. Далее образец нейтрализовали добавлением равного объема раствора однозамещенного двухводного фосфата натрия, на 1 л которого в качестве индикатора рН добавили 40 мг фенолового красного. О нейтрализации образца свидетельствовало изменение окраски раствора от малиновой к оранжевой.

К нейтрализованному образцу добавили 0,1 мл суспензии ферромагнитных микрочастиц, которые до нанесения на их поверхность иммуноглобулина G (IgG) к микобактериям туберкулеза, полученного из сыворотки крови кроликов, гипериммунизированных инактивированными микобактериями, были подвергнуты облучению потоком нейтронов, в результате чего стали радиоактивными. Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, неинтенсивно перемешивая на шейкере. После чего пробирку с образцом на 20 мин помещали в магнитный штатив со встроенными блоками постоянного магнита. Далее пробирку извлекали из штатива, а осевшие на ее стенке под действием магнитного поля ферромагнитные микрочастицы собирали при помощи магнитного зонда-пробоотборника с одноразовым наконечником из полимерного материала, на поверхности которого нанесен иммуноглобулин, аналогичный нанесенному на поверхность ферромагнитных микрочастиц. Зонд-пробоотборник переносили в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость. После извлечения из зонда магнитного сердечника все ферромагнитные микрочастицы, не связанные с бактериальными клетками и через них с поверхностью наконечника, отделились от нее и под действием магнитного поля постоянного магнита собрались на дне отмывочной емкости в виде налета серого цвета.

Извлекли из отмывочной емкости наконечник зонда-пробоотборника и перенесли к устройству регистрации излучения, которое показало наличие излучения. На основании этого сделан вывод о том, что в диагностическом образце содержатся микобактерии туберкулеза.

Из налета на поверхности наконечника, содержащего комплексы ферромагнитных микрочастиц с микобактериями туберкулеза, приготовили мазок, зафиксированный и окрашенный по модифицированному методу Боя. Приготовленный препарат исследован в темном поле люминесцентного микроскопа, при этом обнаружено 8 микобактерий туберкулеза типичной формы, выделяющихся характерным оранжево-желтым свечением.

Пример 2. Исследования биоптата, взятого от животного, больного туберкулезом.

После забоя коровы, положительно реагирующей на внутрикожное введение туберкулина, при патолого-анатомическом исследовании в правом легком обнаружили несколько очагов туберкулеза. Из наиболее крупного очага, имеющего небольшую полость распада, взяли биоптат объемом 20 мл.

Биоптат растерли в ступке со стерильным речным песком, после чего к нему добавили раствор, приготовленный ex tempore из 4% раствора гидроксида натрия и 4% раствора трехзамещенного цитрата натрия в соотношении 1:3 с добавлением N-ацетил-L-цистеина в количестве 100 мг. Для достижения хорошей степени гомогенизации исследуемый материал неинтенсивно перемешивали на шейкере, помещенном в термостат с температурой 37°С, в течение 3 ч. Далее образец центрифугировали при скорости 1500 об/мин в течение 15 мин, супернатант частично удалили, а осадок с остатком супернатанта объемом 20 мл нейтрализовали добавлением равного объема раствора однозамещенного двухводного фосфата натрия, на 1 л которого в качестве индикатора рН было добавлено 40 мг фенолового красного. О нейтрализации образца свидетельствовало изменение окраски раствора от малиновой к оранжевой.

К нейтрализованному материалу добавили 0,1 мл суспензии ферромагнитных микрочастиц, которые были подвергнуты облучению потоком нейтронов, в результате чего стали радиоактивными, после чего на их поверхность нанесли иммуноглобулин к микобактериям туберкулеза бычьего типа, полученный из сыворотки крови кроликов, гипериммунизированных вакцинным штаммом БЦЖ (бациллы Кальметта-Герена). После добавления ферромагнитных микрочастиц образец инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, неинтенсивно перемешивая на шейкере. После чего пробирку с образцом на 20 мин помещали в магнитный штатив со встроенными блоками постоянного магнита. Далее пробирку извлекали из штатива, а осевшие на ее стенке под действием магнитного поля ферромагнитные микрочастицы собирали при помощи магнитного зонда-пробоотборника с одноразовым наконечником из полимерного материала, на поверхность которого был нанесен иммуноглобулин к микобактериям туберкулеза бычьего типа, аналогичный нанесенному на поверхность ферромагнитных микрочастиц. Зонд-пробоотборник переносили в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость. После извлечения из зонда магнитного сердечника все ферромагнитные микрочастицы, не связанные с бактериальными клетками и через них с поверхностью наконечника, отделились от нее и под действием магнитного поля постоянного магнита собрались на дне отмывочной емкости в виде налета серого цвета. Извлекли из отмывочной емкости наконечник зонда-пробоотборника и перенесли к устройству регистрации излучения, которое показало наличие излучения. На основании этого сделан вывод о том, что в диагностическом образце содержатся микобактерии туберкулеза бычьего типа. Из налета на поверхности наконечника, содержащего комплексы ферромагнитных микрочастиц с микобактериями туберкулеза, приготовили мазок, зафиксированный и окрашенный по модифицированному методу Боя. Приготовленный препарат исследовали в темном поле люминесцентного микроскопа, при этом обнаружено более 20 микобактерий туберкулеза типичной формы, выделяющихся характерным оранжево-желтым свечением.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и микробиологии и может быть использовано для выделения и идентификации бактериальных клеток. Изобретение включает в себя гомогенизацию диагностического материала, добавление к нему суспензии ферромагнитных микрочастиц, обладающих свойством радиоактивности, на поверхности которых зафиксированы иммуноглобулины к соответствующим возбудителям бактериальных инфекций, инкубацию при комнатной температуре в течение 60 мин, осаждение ферромагнитных микрочастиц в постоянном магнитном поле в течение 30 мин, введение в полученный осадок ферромагнитных микрочастиц магнитного зонда-пробоотборника со сменным немагнитным наконечником, на поверхности которого зафиксированы иммуноглобулины, аналогичные зафиксированным на поверхности ферромагнитных микрочастиц, помещение наконечника в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость с постоянным магнитом на дне, определение наличия радиоактивности у отмытого наконечника с помощью устройства, регистрирующего радиоактивное излучение. Изобретение обеспечивает выделение бактериальных клеток из диагностического материала с одновременной их идентификацией.

Способ выделения и идентификации бактериальных клеток, включающий гомогенизацию диагностического материала, добавление к нему суспензии ферромагнитных микрочастиц, инкубацию при комнатной температуре в течение 60 мин при перемешивании, осаждение ферромагнитных микрочастиц в постоянном магнитном поле, отличающийся тем, что на поверхности ферромагнитных микрочастиц зафиксированы иммуноглобулины к соответствующим возбудителям бактериальных инфекций и осаждение ферромагнитных микрочастиц в постоянном магнитном поле происходит в течение 30 мин, а ферромагнитным микрочастицам придают свойство радиоактивности, затем в полученный осадок ферромагнитных микрочастиц вводят магнитный зонд-пробоотборник со сменным немагнитным наконечником, на поверхности которого зафиксированы иммуноглобулины, аналогичные зафиксированным на поверхности ферромагнитных микрочастиц, после чего наконечник помещают в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость с постоянным магнитом на дне, а у отмытого наконечника определяют наличие радиоактивности с помощью устройства, регистрирующего радиоактивное излучение, по наличию которого делается вывод о том, что из диагностического образца выделены бактериальные клетки, являющиеся возбудителем соответствующего инфекционного заболевания.