СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА BACILLUS MUCILAGINOSUS Российский патент 1999 года по МПК C12P19/04 C12P19/04 C12R1/07 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных веществ микробного происхождения.

Экзополисахарид слизеобразующей бактерии Bacillus mucilaginosus перспективен для использования в медицине и ветеринарии, в нефтедобывающей и горнодобывающей промышленности, в производстве керамики и технических смазок [Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. Сферы возможного применения культуры Bacillus mucilaginosus // Актуальные вопросы химической науки и технологии, экологии в химической промышленности. Обзорная информация. Вып. 3. М.: НИИТЭХИМ, 1995, 18 с.]. Слизь, продуцируемая Bacillus mucilaginosus, содержит 95% полисахарида.

Известен способ получения полисахарида Bacillus mucilaginosus на плотной питательной среде [Няникова Г.Г. Биосинтез полисахарида Bacillus mucilaginosus и изучение его иммуностимулирующей активности: Дис. канд. биол. наук. Л., 1990, 158 с.] Недостатком этого способа является нетехнологичность процесса промышленного получения полисахарида на плотных средах. Кроме того, используемый для уплотнения среды агар-агар является дорогостоящим ($ 80-160 за 1 кг) и имеющим пищевое значение продуктом.

Известны способы повышения слизеобразования Bacillus mucilaginosus путем выращивания культуры на сенном отваре при 37^oC, при этом микробную взвесь периодически подвергали ультрафиолетовому облучению [А.с. 948142 ССР, МКИ C 12 15/00. Штамм слизистых бацилл Bacillus mucilaginosus, используемый для биосинтеза слизи / Е.Я. Виноградов, А.И. Берденников // Открытия. Изобретения. 1984] . В результате был получен штамм, продуцирующий в 3 раза больше полисахаридсодержащей слизи (100-150 мл / л в сравнении с исходным штаммом 33-50 мл/л) за 16-18 ч.

Прототипом заявляемого является способ получения слизи Bacillus mucilaginosus [А.с. 908797 СССР, МКИ C 12 P 1/04. Способ получения слизи из Bacillus mucilaginosus / Е.Я. Виноградов, В.С. Злобин, В.П. Шичкина и др. // Открытия. Изобретения. 1982, БИ N 48], согласно которому продуцент предварительно выращивают в среде, содержащей 100-200 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и 100-200 мл сенного отвара в течение 1-2 сут, а затем на плотной питательной среде, содержащей мясо-пептонный агар (МПА), 100-200 мл, натрий хлористый 0,5-1,0 г, сахар (глюкозу, сахарозу, мальтозу или левулезу) 1,5-3,0 г в течение 18-24 ч при температуре 37^oC. Данный способ позволяет повысить выход слизи с 30-40 мл/л среды до 100-150 мл/л, т.е. выход слизи вязкостью 8,18 м²/с составил 10-15 об.%.

Недостатками прототипа являются: выращивание продуцента на плотной среде, что не технологично для промышленного получения полисахарида; использование питательных сред, содержащих пищевые, дорогостоящие компоненты (мясо, глюкоза, сахароза); недостаточно высокий выход слизи (10-15 об.%).

Задачей нашего изобретения является повышение выхода полисахарида. Задача решается путем выращивания Bacillus mucilaginosus на жидкой питательной среде, содержащей пептон 0,8 - 1,2 г% мелассу 6 - 8 г; Na₂HPO₄ 0,4 - 0,5; MgSO₄ 0,01 - 0,03; K₂SO₄ 0,01 - 0,03; вода водопроводная 100 мл. Культивирование ведут при температуре 30-32^oC в течение 36 - 40 ч. Для засева используют споровый материал культуры Bacillus mucilaginosus, штамм ВКМ В-1446 Д, подвергнутый воздействию ультрафиолетового излучения при длине волны 255 - 265 нм через промежутки времени, равные 45 мин, 45 мин и 30 мин.

Получение полисахарида при культивировании продуцента в жидкой питательной среде в ферментаторах позволит управлять процессом биосинтеза целевого продукта при контролировании и корректировании параметров ферментации (pH среды, температуры, соотношения питательных компонентов в среде). Использование мелассы - отхода свеклосахарного производства - позволит существенно сократить затраты на среду.

Предлагаемый способ можно проиллюстрировать следующими примерами.

Пример 1. Способ приготовления посевного материала.

Споровый посевной материал Bacillus mucilaginosus штамм ВКМ В-1446 Д получают при культивировании на агаризованном гидролизате казеина с 2% глюкозы при температуре 37^oC в течение 5-6 суток. Биомассу смывают с поверхности среды физиологическим раствором и 2 мл полученной суспензии подвергают УФ-облучению при длине волны 255 - 265 нм. По первому варианту культуру облучают 2 раза по 45 мин. По второму варианту культуру облучают 3 раза с экспозицией 45 мин, 45 мин и 30 мин. После каждого облучения культуру высевают на плотную питательную среду указанного выше состава и инкубируют при температуре 37^oC в течение 24 ч.

При использовании длины волны больше 265 нм или меньше 255 нм, а также отличных от заявляемых продолжительности и числа облучений снижается слизеобразующая способность культуры.

Количество полисахарида определяли по кинематической вязкости, которую измеряли на вискозиметре ВПЖ-1 и рассчитывали по формуле

где V - кинематическая вязкость, см/с;
T - время истечения жидкости, с;
g - ускорение силы тяжести, см/с²;
2,931 - константа вискозиметра.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Примечание к таблице: все опыты проводились в 3-х повторностях. Результаты обработаны статистически, погрешность не превышает 5%.

Как видно из данных, приведенных в таблице, синтез полисахарида культурой, облученной по 2-му варианту, в 6,5 раз превышает синтез полисахарида исходной необлученной культурой. При сравнении полученных данных с прототипом можно установить следующее: в прототипе выход слизи вязкостью 8,18 составил 10-15 об.%, тогда как в нашем опыте выход слизи 100% (во всем объеме среды) вязкостью 23,17.

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа получения посевного материала является повышение выхода полисахарида в 6,5 раз по сравнению с исходным необлученным материалом.

Полученный споровый материал хранится в холодильнике при температуре +4-6^oC и служит посевным материалом для биосинтеза полисахарида. Срок хранения - 6 месяцев.

Пример 2. Биосинтез полисахарида.

Выращивание культуры Bacillus mucilaginosus штамм ВКМ В-1446 Д проводили в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалке со скоростью вращения 200-220 об/мин. Объем среды в колбах 50 мл, объем посевного материала 2 мл. Температура выращивания 30-32^oC, продолжительность культивирования 36-40 ч.

Как видно из чертежа, максимальный выход полисахарида облученной культурой (ряд 2) значительно превышает выход полисахарида необлученной культурой (ряд 1) и составляет 3,0 ст против 1,8 ст. Также чертеж показывает, что максимум накопления полисахарида облученной культурой приходится на 36-38 ч, после чего синтез полисахарида снижается. При наличии неиспользованного углеродного компонента в среде культура продуктивна по полисахариду в течение 40 ч, затем ее синтезирующая способность снижается.

При температуре выращивания продуцента меньше 30 град синтез полисахарида идет неэффективно, при температуре больше 32 град происходит преимущественное накопление биомассы при снижении синтеза полисахарида.

Биосинтез полисахарида осуществляли на среде следующего состава, г: пептон - 0,8-1,2; Na₂HPO₄ - 0,4 - 0,5; MgSO₄ - 0,01 - 0,03; K₂SO₄ - 0,01 - 0,03; меласса - 6,0 - 8,0; вода водопроводная 100 мл. Оптимизацию среды проводили методом вариационной статистики. При использовании значений концентраций компонентов меньше приведенных интервалов замедляется рост культуры и снижается уровень образования ферментов, участвующих в синтезе полисахаридов, что в конечном итоге приводит к низкому выходу последних. Использование в составе среды значений концентраций компонентов больше приведенных интервалов ингибирует синтез полисахарида.

Литература
1. Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. Сферы возможного применения культуры Bacillus mucilaginosus // Актуальные вопросы химической науки и технологии, экологии в химической промышленности. Обзорная информация. Вып. 3. М., 1995, 18 с.

2. Няникова Г.Г. Биосинтез полисахарида Bacillus mucilaginosus и изучение его иммуностимулирующей активности: Дис. канд. биол. наук. Л., 1990, 158 с.

3. А. с. 948142 СССР, МКИ C 12 15/00. Штамм слизистых бацилл Bacillus mucilaginosus, используемый для биосинтеза слизи / Е.Я. Виноградов, А.И. Берденников // Открытия. Изобретения. 1984.

4. А.с. 908797 СССР, МКИ C 12 P 1/04. Способ получения слизи из Bacillus mucilaginosus/ Е.Я. Виноградов, В.С. Злобин, В.П. Шичкина и др. // Открытия. Изобретения. 1982. БИ N 18.

Изобретение относится к области биотехнологии. Для получения полисахарида выращивают Bacillus mucilaginosus на жидкой питательной среде, содержащей пептон 0,8 - 1,2 г, мелассу 6 - 8 г, Na₂НРО₄ 0,4 - 0,5 г MgSO₄, 0,01-0,03 г, K₂SO₄ 0,01 - 0,03 г, воду водопроводную 100 мл. Культивирование ведут при температуре 30-32^oC в течение 36-40 ч. Для засева используют споровый материал культуры Bacillus mucilaginosus, штамм ВКМ В-1446 Д, подвергнутый воздействию ультрафиолетового излучения при длине волны 255-265 нм через промежутки времени, равные 45 мин, 45 мин и 30 мин. Преимущество изобретения заключается в повышении выхода полисахарида. 1 табл., 1 ил.

Способ получения полисахарида Bacillus mucilaginosus путем культивирования посевного материала в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что в качестве посевного материала используют споровую 5 - 6-суточную культуру, облученную УФ-лучами при длине волны 255 - 265 нм последовательно 45 мин, 45 мин и 30 мин с высевами на агаризованную казеиново-глюкозную среду между облучениями, а культивирование ведут при температуре 30 - 32^oС в течение 36 - 40 ч в жидкой питательной среде следующего состава, г:
Пептон - 0,8 - 1,2
Меласса - 6,0 - 8,0
Na₂HPO₄ - 0,4 - 0,5
MgSO₄ - 0,01 - 0,03
K₂SO₄ - 0,01 - 0,03
Вода водопроводная - До 100 мл