Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa - продуцент левана Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения функциональных материалов широкого спектра применения, в нефтедобывающей промышленности.

Известен способ получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 (RU 1698293, МПК С12Р 19/04, опубл. 15.12.1991).

Экзополисахарид, полученный с помощью известного способа, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известно применение штамма Paenibacillus ehimensis IB 739 в качестве продуцента экзополисахарида. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером B-2680D (RU 2460780, МПК C12N 1/20, С12Р 19/04, опубл. 10.09.2012). Первоначально был описан как штамм бактерий для получения препарата против грибковых заболеваний злаковых культур, штамм выделен из почвенного образца серой лесной среднегумусной почвы, отобранной в Бакалинском районе (SU 1743019, МПК А01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 30.05.1994). Штамм способен продуцировать 25 г/л экзополисахарида.

Известен штамм Paeniacillus polymyxa 88А, продуцирующий экзополисахарид полимиксан. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-4556. Штамм получен в результате обработка исходной культуры сублетальными дозами микроволн и затем селекции спонтанных мутантов. В качестве родительского штамма для получения продуцента экзополисахарида был использован штамм Paenibacillus polymyxa 1459В, полученный ранее в ИБФРМ РАН (Глухова, 1986а) из исходного музейного штамма P. polymyxa ССМ 1459 (получен из Чешской коллекции микроорганизмов, ССМ) (RU 1813784, МПК C12P 19/04, опубл. 07.05.1993).

Известен штамм Paenibacillus polymyxa 92, изолированный с корней пшеницы, который образует 38,4 г/л левана на среде, содержащей 10 % сахарозы (Grinev et al., 2020).

Технический результат заключается в создании нового высокопродуктивного штамма бактерии Paenibacillus polymyxa 2020, используемого для получения левана.

Для достижения указанного технического результата предложено применение штамма бактерии Paenibacillus polymyxa 2020, который продуцирует экзополисахарид леван. Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa 2020 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ В-3504Д.

На фиг. 1 представлены клетки бактерий Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д, окрашенные по Граму.

Заявленный штамм выделен из осиных сот с последующей селекцией на основе естественного отбора в ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва».

Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа генов, кодирующих 16S рРНК. По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к виду Paenibacillus polymyxa (99,9%).

Штамм способен продуцировать до 68 г/л экзополисахарида.

Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д идентифицирован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Культурально-морфологические свойства. Клетки цилиндрические с закругленными концами размерами 0,6-0,8×2,5-5,0 мкм, расположены одиночно, попарно и в коротких цепочках; грамположительные (фиг. 1). Споры эллиптические, расположены субтерминально.

Физиолого-биохимические свойства.

Штамм - хемоорганогетеротроф, облигатный аэроб. Штамм хорошо растет на агаризованных средах при температуре 28-30°С. На агаризованной питательной среде № 1 ГРМ с глюкозой (состав, (г/л): глюкоза - 1,0; панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0; панкреатический гидролизат казеина - 10,0; дрожжевой экстракт - 2,0; натрия хлорид - 3,5, агар - 15,0) на третьи сутки роста колонии круглые диаметром 4-6 мм серовато-бежевого цвета, пастообразные. На агаризованной среде с сахарозой в концентрации 20 г/л (состав, (г/л): сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон -10,0; агар - 15,0) колонии круглые, диаметром 3- 6 мм серовато-бежевого цвета, пастообразные. На агаризованной среде с сахарозой в концентрации 140 г/л (состав, (г/л): сахароза - 140,0; дрожжевой экстракт - 20,0; дигидроортофосфат калия - 20,0; хлорид калия - 0,02; хлорид натрия - 0,01; сульфат магния - 0,02; сульфат марганца - 0,01; сульфат железа (II) - 0,01; агар - 18,0) колонии круглые, диаметром 4-10 мм прозрачные, бесцветные, выпуклые с вязкой слизистой консистенцией (фиг. 2). На 5-7 сутки колонии увеличиваются в размере до 10-15 мм.

Процесс секреции экзополисахаридов в культуральную жидкость осуществляется при культивировании указанного штамма бактерии в динамических условиях на качалке при 250 об/мин и температуре 30°С в питательной среде с сахарозой следующего состава, г/л: сахароза - 140,0; дрожжевой экстракт - 20,0; дигидроортофосфат калия - 20,0; хлорид калия - 0,02; хлорид натрия - 0,01; сульфат магния - 0,02; сульфат марганца - 0,01; сульфат железа (II) - 0,01 и среде с мелассой (400 г/л). рH среды - 7,0. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин. Далее экзополисахарид извлекают из культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом в объемном соотношении 1:2. Количество полисахарида, образующееся на третьи сутки культивирования составляет 48 г/л на среде с сахарозой и 68 г/л на среде с мелассой.

Методами ИК- и ЯМР-спектроскопии установлено, что экзополисахарид, образуемый Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д, является леваном - нейтральным гомополисахаридом, состоящим из остатков D-фруктопиранозы, соединенных связями β-2 → 6.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д выращивают в течение 3 сут в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, г/л: сахароза - 140,0; дрожжевой экстракт - 20,0; дигидроортофосфат калия - 20,0; хлорид калия - 0,02; хлорид натрия -0,01; сульфат магния - 0,02; сульфат марганца - 0,01; сульфат железа (II) - 0,01. рH среды - 7,0. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин.

Полученную культуральную жидкость центрифугируют 20 мин при 10 000 об/мин. Далее полисахарид извлекают из супернатанта осаждением этиловым спиртом в объемном соотношении 1:2. Затем полисахарид высушивают при 80°С до постоянной массы. Количество полисахарида определяют весовым методом. Масса сухого полисахарида составляет 48 г/л.

Пример 2. Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д выращивают в течение 3 суток в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, г/л: меласса - 400,0;. рH среды - 7,0. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин.

Полученную культуральную жидкость центрифугируют 20 мин при 10 000 об/мин. Далее полисахарид извлекают из супернатанта осаждением этиловым спиртом в объемном соотношении 1:2. Затем полисахарид высушивают при 80°С до постоянной массы. Количество полисахарида определяют весовым методом. Масса сухого полисахарида составляет 68 г/л.

По сравнению с известным решением предлагаемое обеспечивает образование экзополисахарида левана в количестве 48 и 68 г/л при динамическом культивировании в течение 3 сут на средах с сахарозой и мелассой за счет использования штамма бактерии Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Paenibacillus polymyxa, обладающий способностью синтезировать экзополисахарид леван, депонирован под регистрационным номером ВКМ В-3504Д. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта. 2 ил., 2 пр.

Штамм бактерии Paenibacillus polymyxa ВКМ В-3504Д - продуцент экзополисахарида левана.