ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS MUCILAGINOSUS, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ФИТОПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ И СПОСОБНОСТЬЮ ТРАНСФОРМИРОВАТЬ ТРУДНОДОСТУПНЫЙ ДЛЯ РАСТЕНИЙ ФОСФОР, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Известен штамм Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 (патент РФ №2081867). Указанный штамм обладает способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму. Недостатком штамма является отсутствие у него антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям.

Известен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, прототип (патент РФ №2289621), который повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям. К недостаткам штамма можно отнести невысокую прибавку урожая, получаемую для ряда культур.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и повышающих урожайность сельскохозяйственных культур.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму, что позволяет использовать его в растениеводстве для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.

Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), хорошая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, способность трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ В-10369.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При микроскопировании клетки неподвижные, крупные палочки правильной формы с округлыми концами, одиночные, окружены капсулой. В молодой культуре встречаются клетки в парах, иногда в коротких цепочках.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах в интервале 1,0-1,6×3-7µ. Грамотрицательны, но окраска по Грамму может варьировать.

При выращивании на картофельном агаре (масс.%: картофельный отвар - 98,0; агар - 2,0) и среде Александрова (масс.%: K₂HPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,05; FeCl₂ - следы; сахароза - 0,5; силикаты - 0,1; СаСО₃ - 0,01 (растирается с силикатами); агар - 2,0) при 29±1°С в течение 72-96 часов колонии большие, диаметром 3-8 мм, слизистые, выпуклые, прозрачные, сильно распространяются по всей поверхности питательной среды, полный цикл развития завершается спорообразованием.

При выращивании на агаризованной среде Эшби (масс.%: сахароза - 2,0; K₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO₄ - 0,02; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,5; агар - 2,0) при температуре 29±1°С в течение 96 часов колонии выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые, с ровным краем, вязкой консистенции, диаметром 1-4 мм.

При выращивании на среде Сурмана с мелассой (масс.%: меласса - 0,5; K₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,01; NaCl - 0,05; KNO₃ - 0,1; СаСО₃ - 1,0) при температуре 29±1°С в течение 48 часов культура представляет собой вязкую жидкость; при микроскопировании клетки крупные единичные палочки и споры до 130-250 млн/мл.

На средах без источника азота (среда Эшби) споры не образуются. При перенесении вегетативных клеток со среды Эшби на картофельный агар или на среду Сурмана с мелассой способность к спорообразованию восстанавливается. Споры имеют овальную форму 1,5-1,8µ в диаметре.

На белковых средах (МПА, МПБ, молоке) рост отсутствует (иногда наблюдается очень слабое развитие). Гидролизует крахмал. Желатин не разжижает.

Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, рост возможен в интервале 20-40°С, оптимальная для роста и спорообразования температура 29±1°С.

Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Возможен рост при рН 6,0-8,5, оптимально для роста и спорообразования рН 6,8-7,2.

Отношение к источникам углеводов.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, фруктозе, мальтозе, галактозе, ксилозе, арабинозе. Из спиртов усваивает сорбит, маннит, глицирин, лактат, цитрат. Не усваивает целлюлозу, этанол, бутанол, ацетат.

Отношение к источникам азота.

В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид и нитраты.

Отношение к нерастворимым соединениям фосфора.

Штамм обладает способностью растворять силикаты, апатиты, трикальцийфосфат, нуклеонат натрия, биотит, цеолит (табл.1).

Таблица 1
Влияние штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 на нерастворимые фосфаты № п/п Наименование показателя Числовое значение показателя 1. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) 200 млн/мл 2. Накопление фосфора в жидкой культуре при внесении в среду (в пересчете на Р₂О₅):   - нуклеонат натрия 83,0 мг/мл - трикальций фосфат 25,0 мг/мл - фторапатит 4,0-6,0 мг/мл - цеолит 3,0-5,0 мг/мл

Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям.

Антагонистическую активность определяли методом «лунок» (Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: Высшая школа, 1965, с.131) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах.

Показано, что исследуемый штамм подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium sp. и бактерий Erwinia phytophtora, Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Erysiphe graminis, Septoria graminum, Actinomyces sp. (табл.2).

Таблица 2
Спектр антагонистической активности штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 Тест-культура Зона подавления роста, мм Alternaria sp. 6 Pythium sp. 5 Erwinia phytophtora 4 Rhizoctonia sp. 10 Puccinia triticina 7 Erysiphe graminis 5 Septoria graminum 7 Actinomyces sp. 5

Штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава, масс.%: крахмал - 1,0; K₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; NH₄NO₃ - 0,1; агар - 2,0, при температуре 4±2°С до 3-х лет.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 в лабораторных условиях.

Штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-0000 выращивают в колбах на качалке на жидкой питательной среде следующего состава (масс.%): сахароза - 2,0; K₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NH₄NO₃ - 0,02; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,5, вода - остальное. Колбы засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды и выращивают в течение 72 часов при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании.

Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 250 млн спор/мл, которую используют для обработки почвы и семян.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 в ферментере.

Стерильную питательную среду по примеру 1 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 36 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.

Полученной культурой засевают ферментер объемом 1 м³ с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав (масс.%): меласса - 0,5; K₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,01; NaCl - 0,05; KNO₃ - 0,1; СаСО₃ - 1,0 из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании - аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 60 часов. Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 200 млн спор/мл, которую используют для обработки почвы и семян.

Пример 3. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур. Препарат, полученный по примеру 2, применяют для проведения испытаний в открытом грунте:

- на сахарной свекле и гречихе в НИИ Агропромышленного производства (г.Курск);

- на картофеле во ВНИИ Картофельного хозяйства (Московская область);

- на яровой пшенице в Приморской государственной сельхозакадемии (г.Владивосток);

- на ячмене в Кубанском Государственном аграрном университете (г.Краснодар);

- на озимой пшенице в НИИ Агропромышленного производства (г.Курск).

В каждом случае обработку почвы препаратом проводят перед посевом семян на площади 6 га из расчета 200 мл препарата/га. Для удобства внесения жидкую культуру перед использованием разводят водой в 1000 раз.

В качестве контроля приведены результаты, полученные в аналогичных условиях, но без предварительной обработки почвы препаратом.

Результаты испытаний, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369, оказывает положительное влияние на урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Таблица 3 Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур Обрабатываемые культуры Урожай, ц/га Прибавка урожая контроль препарат ц/га % Озимая пшеница 19,9 22,1 2,2 11,0 Яровая пшеница 13,4 15,3 2,1 14,1 Сахарная свекла 279,0 341,0 62,0 22,2 Гречиха 9,2 10,5 1,3 14,1 Картофель 236,0 319,0 83,0 35,0 Ячмень 17,8 21,4 3,6 12,2

Пример 4. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.

Опыты по изучению влияния препарата, полученного по примеру 2, на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями проводили:

- для яровой и озимой пшеницы в Курском НИИАПП и Ульяновском НИИСХ;

- для картофеля в Брянском филиале ВНИИКХ (г.Брянск).

В каждом случае обработку почвы проводили препаратом на площади 5 га из расчета 200 мл/га. Перед использованием жидкую культуру разводят водой в 1000 раз.

Результаты, приведенные в табл.4, показывают, что степень поражения болезнями значительно меньше в случае предварительной обработки почвы, т.е. препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Таким образом, получен штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, характеризующийся:

- хорошим ростом на производственных средах в условиях глубинной ферментации;

- способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор;

- широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры.

Показано, что жидкая культура, полученная на основе штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, повышает урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к заболеваниям.

Таблица 4 Влияние препарата на степень поражения пшеницы различными болезнями Варианты опыта Яровая пшеница
Степень поражения % Озимая пшеница
Степень поражения % Картофель Ботва Клубни Бурая ржавчина, % Мучни-
стая роса Корневые гнили Бурая ржавчина, % Септориоз, % Фитофтороз, % Вирусные, % Парша, % Ульяновский НИИСХ Контроль 48,4 - 12,5 - - - - - Препарат 33,2 - 7,5 - - - - -- Курский НИИАПП Контроль 25,5 2,5 - 26,5 46,9 - - - Препарат 12,0 1,1 - 12,0 27,9 - - - Брянский филиал ВНИИКХ Контроль - - - - - 8,3 14,9 6,3 Препарат - - - - - 6,2 13,9 4,1

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор. Также штамм может быть применен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Урожайность сельскохозяйственных культур составляет до 341,0 ц/га, а степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями составляет 1,1-33,2%. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор.

2. Применение штамма бактерий Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к заболеваниям.