ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий экзополисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий полисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp. ВКПМ-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с его помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Paenibacillus ehimensis IB 739, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатком известного штамма, принятого за прототип, является низкий выход экзополисахарида и высокая продолжительность культивирования.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента экзополисахаридов.

Поставленная задача решается применением в качестве продуцента экзополисахарида штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с регистрационным номером ВКМ В - 2823D.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KH₂PO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, pH 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,8; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO₄ - 0,1; Fe₂(MoO₄) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; pH 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.

1.3. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 36 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.4. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

1.5. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-36 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10¹⁰ кл/мл.

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Процесс секреции экзополисахаридов в культуральную жидкость осуществляется при ферментации указанного штамма бактерий на питательной среде Федорова с мелассой.

Посредством гель-фильтрации показано, что продуцируемый штаммом полисахарид выходит из колонки одним асимметричным пиком, значение молекулярной массы которого составляет 300 кДа. В ИК-спектре полисахарида присутствуют сигналы, характерные для полос поглощения ацетильных групп 1730, 1250 см^-1, полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца гулуроновой кислоты 1290 и 787 см^-1 и полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца маннуроновой кислоты 1320 и 808 см^-1. Спектры ЯМР ¹H и ¹³C полисахарида типичны для спектров альгинатов. Таким образом, выделенный полисахарид построен из 1-4-связанных остатков β-D-маннуроновой и α-L-гулуроновой кислот (соотношение M/G составляет, в частности, 0,25) и является альгинатом кальция. Полученный полисахарид не растворим в холодной воде, хорошо растворим в горячей воде (при температуре от 60°C).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 продуцирует значительное количество экзополисахарида (27,5 г/л) при выращивании в течение 48 ч в ферментере объемом 10 литров при коэффициенте заполнения 0,7 на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. При температуре процесса, составляющей 25°C, числе оборотов перемешивающего устройства 350 мин^-1, расходе воздуха 100 л/час образовывалась высоковязкая культуральная жидкость с кинематической вязкостью 30000 сСт. Далее экзополисахарид извлекают из культуральной жидкости осаждением изопропиловым спиртом в объемном соотношении 1:1.

Пример 2. При использовании высоковязких экзополисахаридов в нефтедобывающей промышленности важной технологической характеристикой является их растворимость в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. При этом расслоение геля при смешении с пластовой водой или образование осадка недопустимо с точки зрения повышения эффективности процесса добычи нефти при закачке экзополисахаридов в продуктивные пласты. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1, полученной по примеру 1, и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³ в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов, приведенные в табл.1, свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах, не уступающей растворимости штамма по прототипу. Во всех вариантах эксперимента при смешении культуральной жидкости штамма Paenibacillus sp. ИБ-1, содержащей экзополисахарид, с пластовой водой мы получили однородный гель, который не проявлял тенденции к расслоению.

Таким образом, предлагаемый штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает высокой продуктивностью и невысокой продолжительностью культивирования при секреции высоковязкого экзополисахарида в среду. Гель, полученный при этом, обладает хорошей растворимостью в минерализованных пластовых водах.

Таблица 1 Растворимость культуральной жидкости штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1 в нефтепромысловой пластовой воде (минерализация - 140 г/дм³) Наименование штамма бактерий Объемное соотношение 0,1%-ного раствора культуральной жидкости с пластовой водой 1:1 1:3 1:10 1:15 Paenibacillus sp ИБ-1 Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Штамм по прототипу Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579049, кл. C12P 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. C12P 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2460780, кл. C12N 1/20, 2012.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-2823D. Штамм Paenibacillus sp. ВКМ B-2823D обладает способностью продуцировать экзополисахарид и может быть использован, в частности, в нефтеперерабатывающей промышленности. Изобретение позволяет повысить выход экзополисахарида и расширить ассортимент экзополисахаридов, обладающих хорошей реологией и высокой растворимостью в высокоминерализованных пластовых водах. 1 табл., 2 пр.

Применение штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером B-2823D, в качестве продуцента экзополисахарида.