ТЕТРАПЕПТИД TRP-NLE-ASP-PHENH-CH(CH), ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИАЛКОГОЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1999 года по МПК C07K5/10 A61K38/07 

Изобретение относится к органической химии, а именно к синтезу пептидов, обладающих антиалкогольной активностью.

Известен пептид формулы Asp-Туr(SE)-Met-Gly-Trp-Met- Asp-PheNH₂ (CCK-8S), обладающий способностью снижать потребление этанола у хронически алкоголизированных животных при его центральном (в желудочки мозга) введении (В журнале "Нейрохимия", 1996 г., N 2, с. 149). Недостатками этого пептида являются неприемлемость центрального способа введения для практической медицины, а также трудоемкость и высокие экономические затраты при его получении.

Известен пептид - эндогенный тетрапептид холецистокинина Trp- Met-Asp-PheNH₂ (ССК-4, или тетрагастрин) (В журнале "European Neuropsychopharmacology", 1996, v. 6, p. 263). Недостатком этого тетрапептида является его анксиогенная активность, что ограничивает его использование в качестве лекарственного средства. При введении тетрагастрина у здоровых людей в 17% случаев наблюдаются признаки тревоги или паники, а у больных с паническим состоянием в 90% случаев регистрируется увеличение выраженности панических признаков (В журнале "J. Psychiatry-Neuroscience", 1991, v. 16, N 2, p. 91).

Техническим результатом изобретения является создание тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH -CH(CH₃)₂, который обладает антиалкогольной активностью и не оказывает анксиогенного действия при периферическом способе введения, а также удешевление способа его получения.

Этот результат достигается синтезом тетрапептида формулы:
Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃)₂
He вытекает из известного уровня техники, что сокращение пептидной цепочки и замена остатка метионина на остаток норлейцина и C-концевой амидной группы на изопропиламидную в структуре эндогенного ССК-4 будет способствовать наличию антиалкогольной активности и отсутствию анксиогенного эффекта, что делает возможным использование заявляемого тетрапептида в качестве основы для разработки лекарственных средств, обладающих антиалкогольной активностью.

Данный пептид представляет собой белый порошок, растворимый в воде с 20% этанола или ацетонитрила, уксусной кислоте, нерастворимый в гексане, эфире. Пептид гомогенен по данным тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, охарактеризован данными количественного аминокислотного анализа и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).

Синтез пептида осуществляют классическим методом в растворе путем последовательного наращивания пептидной цепи по одной аминокислоте, начиная с C-конца, с использованием активированных эфиров Z, Boc-аминокислот. Боковая карбоксильная функция аспарагиновой кислоты защищалась трет-бутильной группой. Деблокирование Boc-, Bu^t-защищенного тетрапептида проводят действием трифторуксусной кислоты (ТФА) с добавкой 5% деионизованной воды и 5% этандитиола. Очистку целевого продукта проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Ниже приведен пример получения заявляемого препарата.

В работе используют L-аминокислоты и их производные фирм Reanal (Венгрия), Bachem, Fluka (Швейцария).

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляют на хроматографических пластинках Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системах растворителей: хлороформ - метанол - 50% уксусная кислота 90:10:2 (А); этилацетат - гексан 1:1 (Б), хлороформ - метанол - 50% уксусная кислота 85:15:2 (В), хлороформ - метанол - 32% уксусная кислота 15:4:1 (Г). Вещества обнаруживают на пластинках с помощью хлорбензидинового реагента. Гидрирование пептидов проводят в присутствии 10% Pd/C (палладий на угле) фирмы Fluka или Merck (5-10% по весу).

Приведенные температуры плавления (не скорректированы) определяют на нагревательном столике Boetius (Германия).

N, N-диметилформамид (DMF) перегоняют над нингидрином и окисью бария, хлористый метилен промывают концентрированной серной кислотой и водой, сушат над CaCl₂, перегоняют над CaCl₂, затем над гидридом кальция.

Для экстракции из водных растворов, кристаллизации применяют растворители марок ч. и х.ч., для ВЭЖХ - ацетонитрил (Technofarm, Россия).

Аминокислотный анализ пептидов, гидролизованных 6 н. HCl с 2% тиогликолевой кислоты при 110^oC в течение 24 ч, проводят на автоматическом анализаторе Biotronik LC 5001 (Германия).

Аналитическую ВЭЖХ целевого продукта проводят на приборе Gilson (Франция) на колонке (4.6х250мм) Beckman (Ultrasphere ODS) в условиях градиентной элюции буфером Б (80% ацетонитрила + 20% буфера А) в буфере А (0.1% водная трифторуксусная кислота). Детекцию осуществляют при длине волны 220 нм. Препаративную ВЭЖХ тетрапептида проводят на колонке Диасорб 130 С16Т (24х250 мм).

Растворы упаривают на роторном испарителе Buchi (Швейцария) при 40^oC.

Z-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (I). К раствору 1.26 г (3 ммоль) Z-Phe-ONp в 10 мл метанола прибавляют 10 мл 5% раствора изопропиламина в хлороформе, выдерживают 12 ч, упаривают досуха, продукт переосаждают из изопропилового спирта гексаном. Получено 1,0 г (96.7%) соединения (I). R_f 0.86 (А), 0.94 (Г). Т. пл. 154-155^oC.

Z-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (II). 0.50 г (1.5 ммоль) соединения (I) гидрируют в 5 мл смеси метанола, этанола и воды в присутствии Pd/C. Катализатор отфильтровывают, промывают метанолом, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 5 мл DMF, к полученному раствору прибавляют 0.53 г (1.2 ммоль) Z- Asp(OBu^t)ONp. Через 16 ч реакционную смесь концентрируют в вакууме, к остатку добавляют 50 мл 5% раствора NaCO₃. Выпавший белый осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой до нейтральной реакции, переосаждают из изопропилового спирта гексаном. Получено 0.60 г (98%) соединения (II). R_f 0.89 (А), 0.50 (Б).

Z-Nle-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (III). 0.60 г соединения (II) растворяют в 5 мл этанола и гидрируют аналогично соединению (I). Полученный в виде масла продукт гидрирования растворяют в 5 мл DMF, к раствору прибавляют 0.46 г (1.2 ммоль) Z-Nle-ONp. Через 16 ч реакционную смесь обрабатывают аналогично соединению (II). Получено 0.58 г (77%) соединения (III). R_f 0.75 (А), 0.30 (Б).

Boc-Trp-Nle-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (IV). 0.30 г (0.48 ммоль) соединения (III) гидрируют в этаноле аналогично соединениям (I) и (II). Полученный в виде масла продукт растворяют в 3 мл DMF, к раствору прибавляют 0.21 г (0.5 ммоль) Boc-Trp-ONp. Через 16 ч реакционную смесь обрабатывают аналогично соединениям (II) и (III). Получено 0.28 г (71.8%) соединения (IV). R_f 0.34 (А), 0.57 (В).

Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (V). 0.16 г (0.21 ммоль) соединения (IV) растворяют в охлажденной до 0^oC смеси 9 мл трифторуксусной кислоты, 0.5 мл деионизованной воды и 0.5 мл этандитиола. Через 1 ч реакционную смесь концентрируют в вакууме, пептид осаждают холодным сухим эфиром. Сырой продукт деблокирования очищают методом препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе в условиях: колонка Диасорб 130 С16Т (24х250 мм), градиентная элюция буфером Б в буфере А (А - 0.1% ТФА, Б-80% ацетонитрила в А) со скоростью 0.5% в мин, скорость потока 4 мл/мин, детекция при 220 нм. Получено 0.11 г (75%) соединения (V) в виде лиофилизата. R_f 0.28 (В), 0.55 (Г). R_t 18.8 мин в условиях: колонка Beckman (Ultrasphere ODS 4.6 x 250), градиентная элюция буфером Б в буфере А от 20 до 80% в течение 30 мин (буфер А-0.1% ТФА, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А). Т.пл. 132 -140^oC.

Пример 1. Крыс (самцов) породы Вистар начальной массы 100-120 г подвергают хронической алкоголизации путем предоставления животным на протяжении 7 месяцев 10% раствора этанола в качестве единственного источника жидкости при отсутствии ограничений в потреблении стандартного брикетированного корма. После 7 месяцев алкоголизации животных предварительно (в течение 10 дней) тестируют на потребление 10% раствора этанола при одновременном предоставлении животным воды в условиях свободного выбора, как описано в Методических рекомендациях Фармакологического комитета Минздрава по экспериментальному (фармакологическому) изучению препаратов, предлагаемых для клинической апробации в качестве средств для лечения и профилактики алкоголизма (В книге "Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств". Часть 3, Москва, 1981, с. 95. ). После тестирования животные случайным образом разделяют на подгруппы по 10 крыс в каждой. С использованием слепого контроля животным одной группы вводят заявляемый тетрапептид, а другой плацебо - 0,9% раствор NaCl. Инъекцию препарата проводят внутрибрюшинно, ежедневно в течение 5 дней в дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/кг веса животного. Животных тестируют на предпочтительное потребление алкоголя, как описано выше. Результаты определений, проводившихся с использованием слепого контроля, приведены в таблице 1.

Как следует из результатов, представленных в таблице 1, снижение дозы потребляемого алкоголя у контрольных животных в период введения заявляемого тетрапептида в дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/кг было незначительное.

Напротив, введение тетрапептида животным с моделью хронической алкогольной интоксикации сопровождается достоверным снижением дозы потребляемого алкоголя, наиболее выраженным при введении тетрапептида в дозе 2,0 мкг/кг веса.

Пример 2. В эксперименте исследуют способность заявляемого тетрапептида потенцировать действие наркотической дозы этанола (4 г/кг веса внутрибрюшинно). Показателем активности соединения служит изменение "бокового положения" крыс в опытных группах по сравнению с контрольными животными. Опыты проводят на интактных и хронически алкоголизированных животных. Моделирование хронической алкогольной интоксикации проводят способом, аналогичным приведенному в примере 1. Заявляемый тетрапептид вводят внутрибрюшинно в дозе 2,0 мкг/г веса за 15 минут до введения этанола. В качестве плацебо, как и прежде, используют 0,9% раствор NaCl.

Результаты определений приведены в таблице 2. Как следует из представленных в таблице 2 данных, заявляемый тетрапептид не изменяет продолжительность "бокового положения" у контрольных животных и достоверно сокращает его продолжительность у хронически алкоголизированных крыс.

Пример 3. В эксперименте исследуют наличие у заявляемого соединения анксиогенного эффекта. Для решения этого вопроса используют два поведенческих теста: тест "светлая-темная" камера (В журнале "Pharmacol Biochem Behav", 1980, v. 13, p. 167) и тест конфликтной ситуации, или тест Вогеля (В журнале "Psychopharmacol.", 1971, v. 21, p. 1).

Перед тестированием в тесте "светлая-темная" камера у животных в течение 5 минут регистрируют двигательную активность. Затем животных помещают в центр темной камеры и наблюдают в течение 5 минут, регистрируя время нахождения в светлой камере (t в светлой камере в сек) и количество переходов между темной и светлой камерой. Заявляемый тетрапептид вводят внутрибрюшинно за 30 минут до тестирования в дозе 2 мкг/кг веса животного. Уменьшение длительности нахождения животных в светлой камере по сравнению с контрольными животными, получавшими 0,9% раствор NaCl, является показателем наличия у исследуемого соединения анксиогенной активности.

Тестирование животных в тесте Вогеля проводят с использованием камеры "Lick supression test". За 72 часа до эксперимента животных лишают воды при избытке стандартного брикетированного корма. За 24 часа до введения заявляемого тетрапептида животные обучаются навыку обнаружения источника воды. Затем животным внутрибрюшинно вводят заявляемый тетрапептид в дозе 2 мкг/кг веса и через 30 минут в условиях подключения электрического тока силой 0,5 мА к электродному полу камеры и поилке с водой регистрируют количество подходов к поилке и количество шоков, получаемых животным во время нахождения у поилки. Уменьшение количества этих показателей в опытной группе животных по сравнению с контрольной группой, получавшей 0,9% раствор NaCl, является показателем наличия у исследуемого соединения анксиогенной активности.

Полученные в эксперименте результаты представлены в таблице 3.

Можно видеть, что при введении заявляемого тетрапептида время нахождения животных в светлой камере, а также количество подходов к поилке и количество шоков, получаемых в период нахождения животных у поилки, не отличается от аналогичных показателей в контрольной группе. Эти результаты свидетельствуют, что при периферическом введении заявляемого тетрапептида в дозе 2 мкг/кг веса у исследуемого соединения не регистрируется анксиогенного эффекта.

Заявляемый тетрапептид Trp-Nle-Asp-PheNH -CH(CH₃)₂ имеет преимущества перед известными пептидными соединениями, заключающиеся в наличии антиалкогольной активности и отсутствии анксиогенного эффекта при периферическом способе введения, а также удешевлении способа его получения, что позволяет использовать это соединение в качестве основы для разработки лекарственного средства, обладающего антиалкогольной активностью.

Изобретение относится к органической химии, а именно к синтезу пептидов, обладающих антиалкогольной активностью. Описывается новый тетрапептид общей формулы I Trp-Nle-Asp-PheNH-CH(CH₃)₂. Техническим результатом изобретения является создание тетрапептида, который обладает антиалкогольной активностью и не оказывает анксиогенного действия при периферическом способе введения, а также удешевление способа его получения. Предлагаемый тетрапептид может быть использован в качестве основы для разработки лекарственных форм, обладающих антиалкогольной активностью. 3 табл.

Тетрапептид
Trp-Nle-Asp-PheNH-CH(CH₃)₂,
обладающий антиалкогольной активностью.