ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2009 года по МПК C07K14/47 A61K38/17 A61P25/28 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему защитным действием против болезни Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для иммунопрофилактики болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда, в частности βА-(1-42), связываясь с α7-ацетилхолиновым рецептором (АХР), образуют скопления в виде амилоидных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани.

В настоящее время разработаны препараты, которые используются в основном для симптоматического лечения БА. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.

Наиболее широко применяемым классом препаратов для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии являются ингибиторы холинэстераз (ИХЭ). Эти препараты увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. ИХЭ характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других побочных эффектов [Watkins Р.В. et al. J. Am. Med. Assoc. 1994. V.271. P.992-998].

Для симптоматического лечения известен препарат другого класса, модулятор глутаматергической системы, мемантин [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V.148(5). P.379-397]. Наилучшие результаты дает его применение у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа, вместе с тем препарат не обеспечивает полного излечивания БА.

Важным недостатком компенсаторной терапии, является то, что разрабатываемые внутри данного направления методы не ликвидируют причину предполагаемого в настоящее время механизма развития БА-скопления β-амилоида (βA) в виде амилоидных бляшек, разрушающие структуру мозговой ткани. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, способных не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.

В последние годы активно разрабатываются и находятся на стадии клинических испытаний иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания в организме βA. Инъекции препаратами на основе βА (главного структурного компонента амилоидных бляшек) вызывают образование специфических антител, которые способствуют удалению βА из мозга [Shenk D. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V.3(10). P.824-828]. Однако клинические испытания таких препаратов показали, что у 6% испытуемых больных БА вызвала воспалительные реакции в мозге. Данные результаты ставят под сомнение безопасность использования препаратов на основе βА в качестве иммунотерапевтических средств.

Известен наиболее близкий к заявленному препарат, обладающий защитным действием против болезни Альцгеймера, являющийся конъюгатом пептида формулы Gln-Met-Gln-Glu-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Val-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr с гемоцианином улитки (KLH) (I), [О.М.Вольпина с соавт.// Биоорганическая химия. 2008. Т.34. №1. С.50-55]. Пептид, входящий в состав препарата (I) представляет собой синтетическую конструкцию, объединяющую два гидрофильных экстрацеллюлярных участка α7-субъединицы АХР. Иммунизация данным препаратом предотвращает ухудшение памяти у 50% мышей с экспериментально индуцированной БА. Вместе с тем иммунизация мышей препаратом (I) приводит к снижению пространственной памяти у 27% контрольных животных.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих защитным действием против болезни Альцгеймера.

Поставленная задача решается за счет пептида, обладающего защитным действием против болезни Альцгеймера, формулы

Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu

Сущностью изобретения является новый пептидный фрагмент α7-субъединицы АХР формулы Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu (II), получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Предлагаемый препарат относится к имуннотерапевтическим средствам лечения БА. Известно, что промежуточным этапом при накоплении βА в клетке является образование его комплекса с α7 типом АХР [Nagele R.G., D'Andrea M.R., Anderson W.J., Wang H.Y. // Neuroscience. 2002. V.110. P.199-2 II]. При иммунизации заявляемым синтетическим пептидом вырабатываются антитела, способные связываться с α7 типом АХР и препятствовать формированию комплекса с βА и, следовательно, образованию амилоидных бляшек. Техническим результатом изобретения является отсутствие побочных эффектов при использовании пептида, узкая направленность иммунного ответа, высокая эффективность.

Иммунизация заявляемым препаратом (II) по сравнению с препаратом (I) препятствует ухудшению пространственной памяти у большего числа животных с экспериментально индуцированной БА (82%) и предотвращает увеличение мозгового уровня βА. Вместе с тем иммунизация данным пептидом не приводит к ухудшению пространственной памяти у здоровых животных.

В качестве модели БА используют мышей, перенесших операцию удаления обонятельных луковиц головного мозга (ольфакторной бульбэктомии), после которой у животных развиваются морфологические и поведенческие признаки БА.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием алкоксибензильного полимера. Конденсации осуществляют при помощи гексафторфосфата бензтриазол-1-ил-N-окси-бис(диметиламино)урония. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 1. Синтез пептида Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu.

Операция 1.

0,3 г алкоксибензильного полимера с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.

Операция 2. Получение Fmoc-Glu(OBu^t)-полимера (I).

В 4 мл диметилформамида растворяют 0,638 г (1,5 ммоль) Fmoc-Glu(OBu^t)-OH, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°С. Через 10 мин раствор добавляют к алкоксибензильному полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании 12 часов. Полученный Fmoc-Glu(OBu^t)-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют. Содержание Fmoc-Glu(OBu^t) в продукте составляет 1,05 ммоль на 0,3 г полимера.

Операция 3. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (II).

а) Полученный Fmoc-Glu(OBu^t)-полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 4. Получение Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (III).

а) Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,264 г (0,45 ммоль) Fmoc-Cys(Trt)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 5. Получение Fmoc-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (IV).

а) Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,264 г (0,45 ммоль) Fmoc-Cys(Trt)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 6. Получение Fmoc-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (V).

а) Fmoc-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Glu(OBu^t)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полученный полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 7. Получение Fmoc-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (VI).

а) Fmoc-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,207 г (0,45 ммоль) Fmoc-Tyr(Bu^t)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 8. Получение Fmoc-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимера (VII).

а) Fmoc-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимер(VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,174 г (0,45 ммоль) Fmoc-Phe-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 9. Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимера(VIII).

a) Fmoc-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 10. Получение Fmoc-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)- Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (IX).

а) Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Glu(OBu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 11. Получение Fmoc-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (X).

а) Fmoc-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 12. Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимера (XI).

а) Fmoc-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 13. Получение Fmoc-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XII).

а) Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 14. Получение Fmoc-Gly-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XIII).

а) Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 15. Получение Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XIV).

а) Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,152 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 16. Получение Fmoc-Ile-Pro-Gly-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XV).

а) Fmoc-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ile-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 17. Получение Fmoc-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XVI).

а) Fmoc-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 18. Получение Fmoc-Val-Gly-Ilr-Pro-Gly-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XVII).

а) Fmoc-Gly-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Вос)-Glu(OBu^t)-полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 19. Получение Fmoc-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XVIII).

а) Fmoc-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XVII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 20. Получение Fmoc-Asp(Bu^t)-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XIX).

а) Fmoc-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XVIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,185 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asp(Bu^t)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин., промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 21. Получение Fmoc-Trp-Asp(Bu^t)-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys(Вос)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимера (XX).

а) Fmoc-Asp(Bu^t)-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XIX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 22. Получение Fmoc-Glu(Bu^t)-Trp-Asp(Bu^t)-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^l)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Clu(OBu^t)-полимера (XXI).

а) Fmoc-Trp-Asp(Bu^t)-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Arg(Pbf)-Ser(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Arg(Pbf)-Phe-Tyr(Bu^t)-Glu(OBu^t)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-полимер (XX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Glu(Bu^t)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 23. Получение целевого пептида Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Cys-Cys-Lys-Glu (XXII). 0,3 г пептидил-полимера (XXI) обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильтровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ C18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт лиофилизируют.

Данные аминокислотного анализа Asp 1,0(1), Ser 0,8(1), Glu 4,3(4), Pro 0,6(1), Gly 2,2(2), Val 1,0(1), Ile 1,0(1), 0,8(1), Tyr 1,0(1), Phe 1.1(1), Lys 2,0(2), Arg 1.6(2).

По данным масс-спектрометрии МН+2546. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 23,2 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ C18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.

Пример 2. Проведение биологических испытаний.

Эксперименты проводят на мышах NMRI весом 20-30 г.

а) Пептид, полученный по изобретению, растворяют в натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 (PBS) (1 мг/мл). Для получения вакцинирующего комплекса раствор пептида смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Мышам вводят вакцинирующий комплекс в основание хвоста из расчета 100 мкг пептида (0,2 мл) на одно животное.

б) Операцию ольфакторной бульбэктомии проводят на 28 день после иммунизации в стерильных условиях под гексеналовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно) с применением 0,5% раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании. Двустороннее удаление обонятельных луковиц проводят путем аспирации через трепанационное отверстие. Контрольных животных подвергают аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельных луковиц.

в) Через 7 дней после операции проводят повторную иммунизацию пептидом. Раствор пептида в PBS (1 мг/мл) смешивают с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. Мышам вводят вакцинирующий комплекс в основание хвоста из расчета 100 мкг пептида (0,2 мл) на одно животное.

г) Через 20 дней после повторной иммунизации проводят обучение животных в водном лабиринте Морриса. Экспериментальная камера представляет собой пластиковый круглый бассейн с диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой с температурой 23°С. Площадь бассейна условно делится на четыре равных сектора, в одном из которых находится спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забеляется молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.

Для опытов отбирают мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить спасательную платформу. В течение 5 дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно. В результате всех животных обучают находить спасательную платформу менее чем за 10 сек. Затем в течение одной минуты у животных тестируют уровень пространственной памяти при отсутствии спасательной платформы. Состояние пространственной памяти каждого животного оценивают по его способности помнить отсек обучения и выделять его из 3-х других отсеков. В течение 1 минуты учитывают время пребывания животных в каждом отсеке. Обучившимися считают животных, время нахождения которых в отсеке обучения достоверно превышает время нахождения в каждом из других отсеков.

д) Образцы мозга бульбэктомированных и контрольных животных готовят следующим образом: 200-270 мг ткани мозга (кора и гиппокамп) гомогенизируют в 0,5 мл 70% муравьиной кислоты, выдерживают в течение 1 ч, центрифугируют при 100000 g в течение 40 мин, отбирают супернатант, упаривают на роторном испарителе до минимального объема, добавляют 1 мл воды, нейтрализуют раствор до рН 7,4 раствором NaOH и лиофилизируют.

Для иммунологического анализа нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают в течение 1 мин 4% раствором овальбумина в буфере PBS, затем в течение 10 мин 2,5% раствором глутарового альдегида. На мембрану наносят 1 мкл мозговой ткани и выдерживают 1 ч в 2,5% растворе овальбумина в буфере PBS с добавлением 0,1% азида натрия.

На каждую точку с образцом мозговой ткани наносят моноклональные мышиные антитела 4G8 к β-амилоиду в разведении 1:1000 и инкубируют в течение 2 дней. После этого мембрану промывают буфером PBS с 1 М NaCl, PBS с добавлением 0,05% детергента Tween 20, PBS и 4% раствором овальбумина в PBS с добавлением 0,01% азида натрия. Затем наносят биотинилированные лошадиные антитела против IgG мыши в разведении 1:3500 и инкубируют в течение 1 ч. Промывки мембраны повторяют. Далее на мембрану наносят моноклональные антитела к биотину, конъюгированные с пероксидазой (разведение 1:4000).

Мембрану обрабатывают раствором 0,05% перекиси водорода и 0,05% о-фенилендиамина в 0,05 Na-цитратном буфере рН 4,5. Реакцию развития окрашивания останавливают добавлением 12,5% серной кислоты.

Результаты биологических испытаний заявляемого препарата приведены в таблице.

е) Токсичность полученного пептида исследуют на экспериментальных животных в системе in vivo. Исследование проводят на линейных мышах линии Balb/c весом 20 г с использованием максимальной дозы пептида 1 мг, вводимой подкожно. Животных держат под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности исследуемого препарата не выявлено.

Таким образом, получен новый пептид формулы Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu, который обладает защитным действием против болезни Альцгеймера.

Изобретение относится к новому биологически активному соединению -пептиду, обладающему защитным действием против болезни Альцгеймера формулы Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu и может быть использовано для создания препарата для иммунопрофилактики болезни Альцгеймера. 1 табл.

Пептид, обладающий защитным действием против болезни Альцгеймера, формулы: Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu.