Изобретение относится к новому биологически активному препарату олигофуростанозидов из суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной, который может найти применение в медицине, в частности для коррекции иммунного ответа.
В последние годы важное значение приобрели соединения, оказывающие иммсуномодулирующее действие (угнетение или стимуляция клеточного и гуморального иммунного ответа, зависящее от дозы). Большинство из этих соединений относится к природным малотоксичным препаратам. Практическое применение из них получили левамизол, применяющийся главным образом в иммуностимулирующем режиме, и циклоспорин А, применяющийся как иммуносупрессант. В качестве базового объекта (он же - прототип) взят циклоспорин А - новый тип иммуносупрессанта, действующий только на стадии антиген-чувствительных клеток-предшественников. Циклоспорин А допускает активацию регуляторных механизмов клеток-супрессоров, но ингибирует индукцию хелперных и цитотоксичных Т-лимфоцитов. Циклоспорин А наиболее активен при введении во время иммунизации, т.е. он действует на ранней стадии запуска лимфоцитов антигеном и это действие явно отличается от действия азатиоприна или циклофосфамида (1). Недостатком данного препарата является его нефротоксичность при использовании в терапевтических дозах (17-15 мг/кг/день при снижении к концу 1-го месяца до 6 мг/кг/день) (2,3).
У веществ, относящихся к растительным стероидным гликозидам ряда фуростана, к которым относится заявляемый препарат, иммуномодулирующая активность ранее не была обнаружена. В то же время у них известна: 1) антиоксидантная активность и 2) липотропная активность, выражающая в гипохолестероллитическом действии. Препараты, содержащие в качестве активного начала стероидные гликозиды ряда фуростана - полиспонин и диоспонины, применяются в СССР в течение многих лет в качестве антисклеротических препаратов и представляют собой сумму олигофуростанозидов из корневищ диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской, по составу мало отличающихся от заявляемого препарата олигофуростанозидов из суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной.
Цель изобретения - новый иммуномодулятор избирательного действия, не обладающий нефротоксическим действием.
Указанная цель достигается применением препарата олигофуростанозидов из суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной впервые в качестве иммуномодулятора, что соответствует критериям "новизна" и "существенные отличия". Избирательность действия этого препарата осуществляется за счет возведения на структуру и функцию мембран иммунокомпетентных клеток, так как предлагаемый препарат относится к водорастворимым антиоксидантам биогенного типа. Его получают известным способом (5) .
П р и м е р 1. Получение препарата олигофуростанозидов. Препарат получают из суспензионной культуры клеток Dioscorea deltoidea Well (диоскореи дельтовидной), штамм ИФР ДМ-0,5, которую получили в Институте физиологии растений АН СССР. Биомассу для препаративного выделения препарата отбирали в стационарную фазу роста. Препарат олигофуростанозидов выделяли из этой биомассы путем осаждения с белками. Для этого клеточную массу после отделения от культуральной жидкости экстрагируют водой в соотношении 1:(10-20) в течение 2-3 ч. Осадок отделяют центрифугированием, экстракцию повторяют. К объединенной надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до полного насыщения и выдерживают 30 мин. При этом вместе с белками происходит соосаждение низкомолекулярных гликозидов. Полученный осадок обрабатывают 5-6 раз 96% этанолом, осадок отделяют, промывают этанолом. Надосадочную жидкость упаривают в роторном испарителе. В осадке получают препарат олигофуростанозидов, который состоит из двух гликозидов: 1) протодиосцина (26-0-β -D-глюкопиранозил-22-окси-фурост-5-ен-3β , 26-диол 3-0- β -чакотриозид) и 2) дельтозида (26-0-β -D-глюкопиранозил-22-окси-фурост-5ен-3 β ,-26-диол 3-0-β -дельтотриозид). Общая формула препарата
где R для 1) равно 1 молекуле глюкозы и 2 молекулам рамнозы и для 2) R равно 2 молекулам глюкозы и 1 молекуле рамнозы.
Количественный анализ выделенного препарата проводили с помощью спектрометрического метода, основанного на цветной реакции олигофуростанозидов с реактивом Эрлиха - 1%-ный раствор п-диметиламинобензальдегида в смеси метанол: соляная кислота (концентрированная 66:34г). Чистота полученного препарат 80%. Методом жидкостной хроматографии с 25%-ным ацетонитрилом в качестве подвижной фазы с детектированием при 207 нм в составе препарата нашли следующее соотношение между дельтозидом и протодиосцином 10:16. Препарат представляет собой белый, аморфный порошок, растворимый в воде. Стабилен при хранении при +20оС в закрытой склянке.
Иммуномодулирующий эффект препарата и избирательное действие на иммунокомпетентные клетки и иммунорегуляторные их субпопуляции изучены в тестах ин витро (примеры 2-4). Предварительно было изучено цитотоксическое действие препарата на лимфоциты периферической крови человека при культивировании их в течение 72 ч в присутствии препарата в концентрациях от 0,1 до 100 мкг/мл. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью трипанового синего. Процент живых клеток составлял 85-90%, что соответствовало контрольным (без препарата культурам, 10-15% составляла естественная гибель клеток. Таким образом, было показано, что испытуемый препарат в исследованных концентрациях не токсичен.
П р и м е р 2. Влияние препарата олигофуростанозидов на Т-хелперы изучено в реакции бласттрансформации лимфоцитов, индуцированных ФГА. При этом мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной крови дифференциальным центрифугированием на градиенте плотности фиколл-гипака (р-1.077) по Bouym. При постановке реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) лимфоциты в количестве 0,25-0,50 х 106 инкубировали в 1 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки АВ (IV) группы и 5 мкг ФГА-Р (фирмы "Serva"). В момент постановки культуры до ФГА в опытные пробирки вносили испытуемый препарат в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл. Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали через 72 ч, причем за 4 ч до окончания культивирования клеток в культуру вносили 3Н-тимидин в концентрации 0,04 МБК (1 мккюри) на 1 мл культуры. Через 72 ч от начала культивирования каждую пробу переносили на миллипоровые фильтры, отмывали холодным 10%-ным раствором ТХУ и физраствором. Радиоактивность подсчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Результаты выражали в индексе стимуляции, который высчитывали по формуле
ИС =
Результаты представлены в табл.1.
Как видно, действие препарата зависело от концентрации, вызывая либо стимуляцию, либо супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов на митогенный стимул ФГА. Наибольший стимулирующий эффект препарата олигофуростанозидов выражен в концентрации от 0,01 до 0,10 мкг/мл (в 1,5 раза эффект выше по сравнению с контролем). Препарат в концентрации от 1,0 до 100 мкг/мл оказывал ингибирующий эффект на пролиферативный эффект лимфоцитов, индуцированный ФГА, вплоть до полного исчезновения ответа. Циклоспорин А, взятый в качестве тест-препарата, с выраженным иммуносупрессивным действием, в аналогичных концентрациях ингибировал функцию Т-лимфоцитов в тесте РБТЛ.
Как было показано, РТБЛ, индуцированная ФГА, является моделью активации Т-хелперов. Таким образом, исследованный препарат оказывал зависимый от дозы иммуномодулированный (стимулирующий или ингибирующий) эффект на активность Т-хелперов в тесте бласттрансформации, индуцированной ФГА.
П р и м е р 3. Влияние препарата олигофуростанозидов на активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) оценивали, используя в качестве мишеней перевиваемую миелоидную линию К562 человека, которая по многочисленным работам определяется как высоко чувствительная мишень в цитотоксическом тесте. Клетки, тестируемые на активность спонтанных киллеров, получены от здоровых доноров. Перевиваемые линии К562 и постановку цитотоксического теста осуществляли по методу Зарецкой Ю.М. Данные экспериментов представлены в табл.2.
Как видно из табл.2, спонтанный лизис (выход Сч51) в среднем составлял 31%. Уровень активности спонтанных киллеров в контроле без препарата составлял 55 ±4%. На клетки-мишени исследуемый препарат не оказывал токсического эффекта. Лизис клеток К562, обработанных разными дозами препарата, не превышал уровня спонтанного лизиса этих клеток. Средний показатель активности ЕКК после обработки их препаратом олигофуростанозидов в дозе от 0,1 до 10,0 мкг/мл не отличался от контроля.
Таким образом, исследованный препарат в диапазоне доз от 0,1 до 10,0 мкг/мл не оказывал влияния на активность естественных (спонтанных) клеток-киллеров, также как и контрольный препарат - циклоспорин А.
П р и м е р 4. Проводилась также оценка влияния препарата олигофуростанозидов на генерацию и активность Кон-А-Т-супрессоров. Активацию клеток-супрессоров проводили по методу Shou L с соавт. Лимфоциты донора инкубировали в 1 мл среды RPMI 1640 в отсутствии (контроль 1 - спонтанные супрессоры) или в присутствии 60 мкг/мл Клн-А (контроль 2 - индуцированные Т-супрессоры) в течение 48 ч при 37оС. Затем клетки обрабатывали митомицином С, чтобы ингибировать синтез ДНК, и трижды отмывали средой RPMI 1640. К 0,5х106 клеток, проинкубированных с Кон-А (или без него), добавляли 0,5х106 аллогенных лимфоцитов и 5 мкг/мл ФГА фирмы "Serva" (тест-систему). Клетки инкубировали 72 ч, за 4 ч до конца культивирования добавляли 3Н-тимидин. Результаты рассчитывали по формуле:
(1 - ) х 100% где Р - число имп/мин в опытных культурах с Кон-А, К-то же в культурах без Кон-А. Испытуемый препарат добавляли в инкубационные среды с Кон-А в концентрациях 0,1, 1,0, 10,0, 100,0 мкг/мл и инкубировали 48 ч при 37оС - для оценки влияния их на генерацию Кон-А индуцированных Т-супрессоров. Все эксперименты проводили дважды по 3-5 параллелей в каждом опыте. Данные представлены в табл.3.
Как видно из табл.3, уровень бласттрансформации тест-клеток при добавлении к ним лимфоцитов, инкубированных 48 ч при 37оС без Кон-А (контроль 1), за счет индукции спонтанных Т-супрессоров, составил 80% уровня бласттрансформации клеток, стимулированных ФГА, который принят за 100% (контроль). Внесение в тест-систему клеток, инкубированных с Кон-А, приводило к снижению уровня бласттрансформации до 20% от контроля за счет ингибирующего действия индуцированных Кон-А-Т-супрессоров (контроль 2). Культивирование лимфоцитов в присутствии препарата олигофуростанозидов и Кон-А в течение 48 ч при 37оС и внесение их после отмывки в тест-систему угнетало бласттрансформацию тест-клеток практически до спонтанного уровня (5-10%). Это может быть следствием увеличения количества индуцированных Кон-А-Т-супрессоров за счет стимулирующего влияния исследуемого препарата на их генерацию. Циклоспорин А в дозах от 0,1 до 10,0 мкг/мл не оказывал влияния на Т-супрессоры (% % бласттрасформации остается на уровне контроля 2), доза 100,0 мкг/мл является для циклоспорина А цитотоксической, поэтому % бласттрансформации снижен до 10%.
Были также проведены эксперименты по изучению влияния предлагаемого препарата по сравнению с известным иммуномодулятором левамизолом на формирование гиперчувствительности замедленного типа у мышей после иммунизации их эритроцитами барана (пример 5). Влияние препарата олигофуростанозидов на формирование ГЗТ у мышей.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) является типичной моделью клеточно-опосредованных иммунных реакций ин виво, которые играют центральную роль в отторжении аллотрансплантата, резистентности к злокачественным опухолям и инфекции.
Воздействуя препаратом до или после сенсибилизации антигеном и оценивая степень проявления РГЗТ, определяли не только на какую из фаз иммунного ответа - индуктивную (до антигенного стимула) или продуктивную (после антигена), в большей степени оказывает действие препарат, но и оценивали чувствительность к нему различных субпопуляций Т-лимфоцитов, вовлеченных в РГЗТ. В качестве сенсибилизирующего антигена использовали эритроциты барана (ЭБ) у мышей. РГЗТ и ЭБ оценивали по разнице веса контрольной и опытной (после введения разрешающей дозы антигена) лапок.
Изучение влияния нового препарата олигофуростанозидов на формирование реакции ГЗТ у мышей к ЭБ проводили при введении препарата по схемам: за 2 дня до иммунизации, за 1 день до иммунизации и в день иммунизации (-2,-1,0 дни) (влияние на пре-Т-супрессоры) и по схеме: в день иммунизации и на 1 и 2 сут после иммунизации (0,+1,+2 дни) (влияние на Тгзт-эффекторы). Данные представлены в табл.4.
Дозы препаратов выбирались пропорционально терапевтическим дозам препаратов (для препарата олигофуростанозидов учитывалась терапевтическая доза для полиспонина).
Результаты эксперимента показали, что в исследованных дозах препарат олигофуростанозидов оказывает преимущественное влияние на зрелые Тгзт-эффекторы (при введении препарата по второй схеме). Эффект статистически достоверен. Циклоспорин А - прототип - не оказывает влияния на Тгзт-эффекторы (другой механизм действия). Левамизол - аналог - оказывает действие как на пре-Т-супрессоры, так и на зрелые Тгзт-эффекторы при обоих схемах введения, 6-меркаптопурин (контроль к левамизолу) не оказывает влияния ни на клетки-предшественники (при введении по 1 схеме ни на Тгзт-эффекторы (при введении по второй схеме). Полученные результаты показывают, что по механизму действия заявляемый препарат отличается от механизма действия циклоспорина А (прототип). Наиболее вероятно, что его действие в используемой дозе связано со стимуляцией Т-супрессорной активности.
Таким образом, в трех тестах клеточного иммунитета ин витро и в тесте РГЗТ ин виво показано иммуномодулирующее действие препарата олигофуростанозидов, выделенного из суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной, относящемуся к классу стероидных гликозидов и обладающих антиоксидантным действием, зависящее от дозы и схемы введения относительно антигенного стимула.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ИХ ОСНОВЕ СПЛЕНОПИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 1998 |
|
RU2152219C1 |
Средство защиты растений от галловых нематод | 1991 |
|
SU1805851A3 |
Средство,обладающее иммунодепрессивным действием | 1978 |
|
SU933096A1 |
Способ выбора донора при аллотрансплантации почки | 1989 |
|
SU1725124A1 |
ЖИВАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГЕПАТИТА В И НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ ДЛЯ НАКОЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 1992 |
|
RU2073524C1 |
Штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea Wall) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro N89 - продуцент протодиосцина | 2016 |
|
RU2647760C2 |
Способ определения состояния макроорганизма | 1990 |
|
SU1782321A3 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНОГО РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ К ЛЕВАМИЗОЛУ | 1986 |
|
RU2014605C1 |
Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3-нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием | 1979 |
|
SU790622A1 |
ИММУНОДЕПРЕССАНТ | 1989 |
|
RU2045265C1 |
Изобретение относится к медицине, а именно к новому биологически активному препарату олигофуростанозидов из суспензионной культуры диоскорей дельтовидной, и может найти применение для коррекции иммунного ответа. Цель изобретения - новый иммуномодулятор избирательного действия, не обладающий нефротоксическим действием. Указанная цель достигается применением препарата олигофуростанозидов из суспензионной культуры диоскореи дельтовидной впервые в качестве иммуномодулятора. Избирательность действия этого препарата осуществляется за счет воздействия на структуру и функцию мембран иммунокомпетентных клеток, так как предлагаемый препарат относится к водорастворимым антиоксидантам биогенного типа. 4 табл.
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО.
Применение препарата олигофуростанозидов из суспензионной культуры дискореи дельтовидной, содержащего протодиосцин и дельтозид общей формулы
где R для протодиосцина равно одной молекуле глюкозы и двум молекулам рамнозы, а для дельтозида - двум молекулам глюкозы и одной рамнозы,
в качестве иммуномодулирующего средства.
Машковский М.Д | |||
Лекарственные средства | |||
- М., 1987, ч.2, 1с.169-171. |
Авторы
Даты
1995-01-27—Публикация
1988-08-16—Подача